לאחר שיבוט הגן המעניין ב- ITR הקשור לאדנו המכיל פלסמיד, זרעו שלוש פעמים 10 עד התאים החמישיים לצלחת בת שש בארות באמצעות DMEM שחומם מראש בתוספת 10% FBS. אפשרו לתאים לגדול ב-37 מעלות צלזיוס וב-5% פחמן דו-חמצני כדי להגיע למפגש של 75% עד 90%. לאחר מכן, להמיס 100 מיליגרם של פוליאתילנימין הידרוכלוריד או PEI מקסימום ב 100 מיליליטר של מים מזוקקים כדי ליצור מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר מלאי.
התאם את ה- pH ל- 7.1 באמצעות נתרן הידרוקסידי. לאחר מכן לעקר את התערובת באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ולאחסן את מגיב במשך חודש אחד בארבע מעלות צלזיוס. בצינור של שני מיליליטר, הוסף פלסמיד 1.3 מיקרוגרם חזרה/מכסה, 1.3 מיקרוגרם ITR המכיל פלסמיד, ופלסמיד עוזר אדנווירוס 2.6 מיקרוגרם ל- DMEM ללא סרום.
הנפח הכולל של תערובת זו צריך להיות 100 מיקרוליטר. הכינו בקרה שלילית בצינור נפרד, והחליפו פלסמיד חזרה/כובע בפלסמיד שאינו קשור. עכשיו להוסיף 5.2 מיקרוליטר של PEI max לתערובת פלסמיד.
זה שומר על יחס פלסמיד ל- PEI שווה. מערבלים בעדינות 10 עד 15 פעמים על מערבל מערבולת להגדיר לשבע. עבור וקטורים מרובים, יש לדשדש את חיבור PEI במרווחים של דקה אחת למשך זמן מספיק בשלבים הבאים.
דוגרים על כל צינור בדיוק 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לדלל את התגובה על ידי הוספת 1.9 מיליליטר של DMEM ללא סרום כדי להשיג נפח סופי של שני מיליליטר. יש לערבב פיפטה בעדינות פעמיים כדי לערבב את התכולה.
שאפו את התקשורת מהבאר. הוסיפו בזהירות את תערובת הפלסמיד PEI לדפנות הבאר כדי למנוע ניתוק תאים ולדגור על תאים במשך 72 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן להקפיא את הצלחת של תאים נגועים במשך 30 דקות ב מינוס 80 מעלות צלזיוס ולהפשיר במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
חזור על המחזור בסך הכל שלוש פעמים. במכסה מנוע של זרימה למינרית, מערבבים כל באר על ידי פיפטינג כדי לשבש את התאים ביעילות. מעבירים את הליזט לצינור של שני מיליליטר.
צנטריפוגה ב 15, 000 גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר פסולת התא בזהירות להעביר את supernatant לצינור שני מיליליטר חדש לאחסן את הצינור בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, צלחת את סוג התא הרצוי בצלחת 96 באר לדגור עבור מפגש מטרה של 50 עד 75% בהתאם למשך הטרנסדוקציה. למחרת, בצע סדרת דילול של אחד עד שלושה של ההכנה הגולמית במדיה נטולת סרום כדי לקבל את הכמות האופטימלית של וקטור הדרוש להתמרה.
לאחר מכן שואפים את התקשורת מן צלחת 96 באר ולהוסיף 50 עד 100 מיקרוליטר של הכנה גולמית מדולל לבארות. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. כדי לקבוע את יעילות הטרנסדוקציה, התבונן בביטוי של כתב הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 48 שעות לאחר הטרנסדוקציה.
לניתוח נוסף, הסירו את הווקטור ושטפו תאים פעם אחת עם PBS שחומם מראש. לבסוף, לסיים את ההתמרה על ידי קיבוע תאים ב 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות. נתוני יעילות ההפחתה הצביעו על כך ש-AAV2 ו-KP1 היו הסרוטיפים החזקים ביותר בכל קווי התאים שנבדקו.
HEPA1-6 הציג ירידה ניכרת בהתמרה בהשוואה ל- Huh7. AAV2 התמיר ביעילות מיובלסטים HSKMC בלתי מובחנים וצינורות HSKMC מובחנים. תנאי מדיה שונים ממלאים תפקיד חשוב במהלך הטרנסדוקציה.
אורגנואידים של עכברים במעי דק שגודלו בתרבית במצע שלפני הטרנסדוקציה עברו המרה פחות יעילה בהשוואה לאלה שגודלו בתרבית במצע גידול אורגנואידים.
