כדי להתחיל, קחו את תערובת הטיפות המופשרת דיגיטלית, או ddPCR מאסטר מיקס והוסיפו לה בדיקות, פריימר קדמי ופריימר הפוך בטמפרטורת החדר. הכינו את התמהיל הראשי לכל יעד הגברה בהתאם להרכב המוצע המוצג על המסך, והתאימו את ריכוזי הפריימרים והגשושיות לפי הצורך. מערבבים את התערובת ביסודיות וצנטריפוגות אותה לזמן קצר במיני צנטריפוגה.
מוסיפים את אנזים ההגבלה והופכים כדי לערבב. לאחר מכן, מוסיפים 16.5 מיקרוליטר של תערובת האב מוכן לכל באר של צלחת PCR ואוטמים את הצלחת עם סרט דבק שקוף. שימוש במאגר דילול הדגימה כמדלל, הכנת בקרת איכות או דילול QC כמתואר בטבלה זו המייצגת את הריכוזים המומלצים לדיוק ודיוק תיקוף.
יש לדלל את דגימות הדמעות באמצעות מאגר דילול דגימות ביחס של 1 ל-10 בצינורות PCR של 0.2 מיליליטר ולאטום את הצינורות. חממו את הדגימות בתרמוסייזר בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות. הסר את סרט ההדבקה מצלחת ddPCR המכילה את תערובת האב והוסף 5.5 מיקרוליטר של דילול QC לבארות מתאימות של צלחת 96 בארות כפי שמוצג במפת הלוחות.
לאחר מכן להוסיף 5.5 מיקרוליטר של מדגם לבארות. הוסף 5.5 מיקרוליטר של מאגר דילול דגימה לפקד ללא תבנית, או בארות NTC. דלל 2x ddPCR בקרת חיץ ביחס של 1 ל -2 באמצעות מים נטולי נוקלאז והוסף 22 מיקרוליטר של החיץ לכל בארות ריקות של עמוד.
מוסיפים אטם רדיד אלומיניום לצלחת ומניחים את הצלחת באטם הצלחת. אטמו את הצלחת למשך 5 שניות בחום של 180 מעלות. מערבבים את הצלחת במהירות המרבית למשך 30 שניות לפחות וצנטריפוגות לזמן קצר בספינר צלחות.
במסך המגע של מחולל הטיפות האוטומטי, בחר את העמודות במפת הלוחות המכילות את הדגימות. הסיפון של המכשיר יואר כדי לציין אילו חומרים מתכלים נדרשים. טען את מחולל הטיפות מאחור לחזית.
האור הצהוב ישתנה מצהוב לירוק כדי לציין את הספיקה של החומרים המתכלים. מניחים גוש קר ואת מחזיק צלחת הטיפה. ודא שהבלוק בצבע כחול מלא ולא נראה ורוד.
מניחים צלחת ddPCR חדשה עם ריתוך 96 בבלוק הקר. הניחו את צלחת ה-PCR המוכנה במחזיק צלחת הדגימה. סגור את מכסה ההתקן ולחץ על Start ליצירת טיפות.
תוך 30 דקות, הסר את הצלחת המכילה את הטיפות מהגוש הקר. מוסיפים אטם רדיד אלומיניום לצלחת ומניחים את הצלחת באטם הצלחת. אטמו אותו למשך חמש שניות בטמפרטורה של 180 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן הניחו את הצלחת במחזור תרמי תואם והזינו את תנאי הרכיבה המוצגים על המסך. טען את הצלחת לקורא הטיפות כדי להבטיח שיישאר מספיק שמן קורא ולמיכל הפסולת יהיה מספיק מקום. לבסוף, לחץ על כפתור הקריאה בתוכנה כדי להתחיל לקרוא את הטיפות.
ממוצע תוך בדיקה עבור כל ריכוז בכל בדיקה חושב וזה שימש להערכת הדיוק והדיוק של הבדיקה. דיוק ממוצע בין בדיקות של 7.7% ודיוק מוחלט ממוצע של 4.2% נמצאו בכל רמות ה-QC. דיוק ודיוק בין בדיקות חושבו גם באמצעות הממוצע הבין-מבחני של כל רמת QC בתוך כל אצווה.
נמצאו דיוק בין בדיקות הנע בין 4% ל-8.5% ודיוק מוחלט בין בדיקה אחת ל-3.2%. באופן דומה, עבור דגימת הדמעות נצפה דיוק ממוצע בין בדיקות של 3.7% ברמת הספייק הגבוהה ו-12.2% ברמת הספייק הנמוכה ודיוק מוחלט ממוצע בין בדיקות של 11.3% ברמה הגבוהה ו-8.1% ברמה הנמוכה. במקרה של חישוב בין-מבחן, נמצא דיוק של 5.5% ברמה הגבוהה ו-7.1% ברמה הנמוכה ודיוק מוחלט של 11.3% ברמה הגבוהה ו-8.1% ברמה הנמוכה.
