ברצוננו להודות לניק ראסל וברנדון מקייטן מ-Bio-Rad על הדיונים המועילים שלהם במהלך פיתוח שיטה זו.

כימות וקטורים נגיפיים בדמעות באמצעות ddPCR למחקרי ביושפדינג

<ol>
	<li>Sherkow, J. S., Zettler, P. J., Greeley, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+it+'gene+therapy.">Is it 'gene therapy.</a> Journal of Law and the Biosciences. 5 (3), 786-793 (2018).</li><li>Ginn, S. L., Amaya, A. K., Alexander, I. E., Edelstein, M., Abedi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+clinical+trials+worldwide+to+2017:+an+update.">Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: an update.</a> The Journal of Gene Medicine. 20 (5), 3015 (2018).</li><li>Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vector+systems+for+gene+therapy:+a+comprehensive+literature+review+of+progress+and+biosafety+challenges.">Viral vector systems for gene therapy: a comprehensive literature review of progress and biosafety challenges.</a> Applied Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).</li><li>Gene, Cell, &amp; RNA therapy landscape, Q4 2022 quarterly data report. American Society for Gene &amp; Cell Therapy Available from: <a target="_blank" href="https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx">https://asgct.org/global/documents/asgct_citeline-q4-2022-report_final.aspx</a> (2022)</li><li>Approved Cellular and Gene Therapy Products. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products</a> (2022)</li><li>Au, H. K. E., Isalan, M., Meilcarek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+advances:+a+meta-analysis+of+AAV+usage+in+clinical+settings.">Gene therapy advances: a meta-analysis of AAV usage in clinical settings.</a> Frontiers in Medicine. 8, 809118 (2022).</li><li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+in+gene+therapy.">Viral vectors in gene therapy.</a> Diseases. 6 (2), 42 (2018).</li><li>Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+(AAV)+as+a+vector+for+gene+therapy.">Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy.</a> BioDrugs. 31, 317-334 (2017).</li><li>Russell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+voretigene+neparvovec+(AAV2-hRPE65v2)+in+patients+with+RPE65-mediated+inherited+retinal+dystrophy:+a+randomized,+controlled,+open-label,+phase+3+trial.">Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomized, controlled, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).</li><li>Chemistry, manufacturing, and control (CMC) information for human gene therapy investigational new drugs (INDs). United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/chemistry-manufacturing-and-control-cmc-information-human-gene-therapy-investigationsal-new-drug</a> (2020)</li><li>Long term follow-up after administration of human gene therapy products. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/long-term-follow-after-adminstration-human-gene-therapy-products</a> (2020)</li><li>Testing of retroviral vector-based human gene therapy products for replication competent retrovirus during product manufacture and patient follow-up. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/testing-retroviral-vector-based-human-gene-therapy-products-replication-competent-retrovirus-during</a> (2020)</li><li>Recommendations for microbial vectors used in gene therapy. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/recommendations-microbial-vectors-used-gene-therapy</a> (2016)</li><li>Multidisciplinary: gene therapy. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy">https://www.europa.eu/en/human-regulatory-development/scientific-guidelines/multidisciplinary/multidisciplinary-gene-therapy</a> (2023)</li><li>Human gene therapy for retinal disorders. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/human-gene-therapy-retinal-disorders</a> (2020)</li><li>Design and analysis of shedding studies for virus or bacterial-based gene therapy and oncolytic products. United States Food and Drug Administration Available from: <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products">https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/design-and-analysis-shedding-studies-virus-or-bacteria-based-gene-therapy-and-oncolytic-products</a> (2015)</li><li>Guideline on the quality, non-clinical and clinical aspects of gene therapy medicinal products. European Medicines Agency Available from: <a target="_blank" href="https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf">https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-quality-non-clinical-clinical-aspects-gene-therapy-medicinal-products_en.pdf</a> (2018)</li><li>Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=white+paper+on+recent+issues+in+bioanalysis:+mass+spec+of+proteins,+extracellular+vesicles,+CRISPR,+chiral+assays,+oligos;+nanomedicines+bioanalysis;+ICH+M10+section+7.1;+non-liquid+&amp;+rare+matrices;+regulatory+inputs+(part+1A+-+recommendations+on+endogenous+compounds,+small+molecules,+complex+methods,+regulated+mass+spec+of+large+molecules,+small+molecule,+PoC+&amp;+part+1B+-+regulatory+agencies'+inputs+on+bioanalysis,+biomarkers,+immunogenicity,+gene+&amp;+cell+therapy+and+vaccine).">white paper on recent issues in bioanalysis: mass spec of proteins, extracellular vesicles, CRISPR, chiral assays, oligos; nanomedicines bioanalysis; ICH M10 section 7.1; non-liquid &amp; rare matrices; regulatory inputs (part 1A - recommendations on endogenous compounds, small molecules, complex methods, regulated mass spec of large molecules, small molecule, PoC &amp; part 1B - regulatory agencies' inputs on bioanalysis, biomarkers, immunogenicity, gene &amp; cell therapy and vaccine).</a> Bioanalysis. 14 (9), 505-580 (2022).</li><li>Hays, A., Islam, R., Matys, K., Williams, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Best+practices+in+qPCR+and+qPCR+validation+in+regulated+bio+analytical+laboratories.">Best practices in qPCR and qPCR validation in regulated bio analytical laboratories.</a> The AAPS Journal. 24 (2), 36 (2022).</li><li>Ma, H., Bell, K. N., Loker, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCR+and+qRT-PCR+analysis:+Regulatory+points+to+consider+when+conducting+biodistribution+and+vector+shedding+studies.">qPCR and qRT-PCR analysis: Regulatory points to consider when conducting biodistribution and vector shedding studies.</a> Molecular Therapy. Methods &amp; Clinical Development. 17 (20), 152-168 (2020).</li><li>Wissel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+on+qPCR/ddPCR+assay+validation+by+GCC.">Recommendations on qPCR/ddPCR assay validation by GCC.</a> Bioanalysis. 14 (12), 853-863 (2022).</li><li>Expectations for biodistribution (BD) assessments for gene therapy (GT) products. International Pharmaceutical Regulators Programme Available from: <a target="_blank" href="https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf">https://admin.iprp.global/sites/default/files/2018-09/IPRP_GTWG_ReflectionPaper_BD_Final_2018_0713.pdf</a> (2018)</li><li>Pinheiro, L., Emslie, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+concepts+and+validation+of+digital+PCR+measurements.">Basic concepts and validation of digital PCR measurements.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 11-24 (2018).</li><li>Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+counting+statistics+in+digital+PCR:+I+measured+two+target+copies-what+does+it+mean.">Fundamentals of counting statistics in digital PCR: I measured two target copies-what does it mean.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 25-43 (2018).</li><li>Prantner, A., Marr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+concentration,+characterization,+and+integrity+analysis+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+using+droplet+digital+PCR.">Genome concentration, characterization, and integrity analysis of recombinant adeno-associated viral vectors using droplet digital PCR.</a> PLoS One. 18, 0280242 (2023).</li><li>Primer-BLAST. National Library of Medicine, National Center for Biotechnology Information Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/">https://www.ncbi.nim.nih.gov/tools/primer-blast/</a> (2023)</li><li>Koressaar, T., Remm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancements+and+modifications+of+primer+design+program+Primer+3.">Enhancements and modifications of primer design program Primer 3.</a> Bioinformatics. 23 (10), 1289-1291 (2007).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer-BLAST:+A+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction.">Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).</li><li>Droplet Digital PCR Application Guide. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf">https://www.bio-rad.com/webroot/we/pdf/lsr/literature/Bulletin_6407.pdf</a> (2023)</li><li>Qian, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+A+technology+review.">dPCR: A technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Basu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+assays+part+I:+portioning+statistics+and+digital+PCR.">Digital assays part I: portioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technology. 22 (4), 369-386 (2017).</li><li>Sanmiguel, J., Gao, G., Vandeberghe, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+digital+droplet-based+AAV+genome+titration.">Quantitative and digital droplet-based AAV genome titration.</a> Methods in Molecular Biology. 1950, 51-83 (2019).</li><li>Bachhuber, F., Huss, A., Senel, M., Tumani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+biomarkers+in+tear+fluid:+from+sampling+to+preanalytical+processing.">Diagnostic biomarkers in tear fluid: from sampling to preanalytical processing.</a> Scientific Reports. 11, 10064 (2021).</li><li>Martinez-Fernandez de la Camara, C., McClements, M. E., MacLaren, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+of+AAV+vector+genomes+by+quantitative+PCR.">Accurate quantification of AAV vector genomes by quantitative PCR.</a> Genes. 12 (4), 601 (2021).</li><li>Ai, J., Ibraheim, R., Tai, P. W. L., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+and+accurate+method+for+quantifying+vector+genomes+of+recombinant+adeno-associated+viruses+in+crude+lysate.">A scalable and accurate method for quantifying vector genomes of recombinant adeno-associated viruses in crude lysate.</a> Human Gene TherapyMethods. 28 (3), 139-147 (2017).</li><li>Dobnik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+and+characterization+of+adeno-associated+viral+vectors.">Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1570 (2019).</li><li>Bennett, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+stability+as+a+determinant+of+AAV+serotype+identity.">Thermal stability as a determinant of AAV serotype identity.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 6, 171-182 (2017).</li></ol>

כל המחברים הם עובדים של KCAS Bioanalytical and Biomarker Services, ארגון מחקר קבלני המספק שירותי פיתוח מקיפים התואמים ל-Good Laboratory Practices/Good Clinical Practices החל מתמיכה בגילוי מוקדם ועד לרישום מוצרים, כולל תמיכה בבדיקות מבוססות AAV, כמתואר בפרוטוקול זה. KCAS מימנה פרויקט זה ופרסום פרוטוקול זה. אמנם אין הנחיות עדכניות של ה- FDA לתכנון ותיקוף של הניסויים המוצגים במאמר זה, אך המומחים ומובילי הדעה המפתחים מחקרים כאלה ב- KCAS אימצו גישה זו כגישה הבסיסית. קריטריונים ופרמטרים נוספים נדונים על בסיס פרויקט אחר פרויקט ועשויים להיכלל על בסיס השימוש המיועד.

ישנם מספר שלבים של פרוטוקול ddPCR שהם קריטיים לביצועים נאותים של הבדיקה. השלב הקריטי הראשון הוא תכנון ואופטימיזציה של פריימרים ובדיקה. באופן כללי, מומלץ להשתמש בכימיה מבוססת בדיקת הידרוליזה על פני כימיה מבוססת צבע (למשל, SYBR Green) בסביבה פרה-קלינית או קלינית בשל הספציפיות הגבוהה שלהם. בנוסף, בחירת יעד ההגברה היא קריטית. בדרך כלל, טרנסגן העניין של הווקטור ממוקד. עם זאת, בשלבים פרה-קליניים מוקדמים יותר או בווקטורים שבהם ייתכן שלא ניתן להבחין בין טרנסגן וקטורי לעומת דנ"א גנומי, ייתכן שיהיה נכון להשתמש במטרות וקטוריות סטנדרטיות. לדוגמה, ניתן לכוון לאזור החוזר הטרמינלי ההפוך, למקדם, לזנב פולי-A, או לצמתים הבין-מקטעים בין רכיבים וקטוריים אלה. בחירת המטרה תשתנה בהתאם לתכנון הווקטורי. פריימר qPCR מסורתי ואסטרטגיות תכנון בדיקה ותוכנה מתאימים בדרך כלל ל- ddPCR. יש לבחור פרמטרים של תכנון שצפויים להניב טמפרטורת חישול עקבית (לדוגמה, 60°C) כדי להפחית את כמות המיטוב הנדרשת. כמו כן, הומלץ לתכנן, להזמין ולהעריך לפחות שלוש קבוצות שונות עבור כל מטרה. לאחר מכן יש לבחור את הקבוצה שמראה את הספציפיות הגדולה ביותר (ללא הגברה בבאר הבקרה השלילית או במטריצה של דנ"א מטרה קשור) ואת הרגישות (כלומר, גבול הזיהוי)20.
אם יש יתרון ביכולת להעביר את הבדיקה בין qPCR ל- ddPCR, מומלץ לייעל תחילה את תנאי הבדיקה באמצעות qPCR, ולזהות תנאים לקבוצה שנבחרה המביאים ליעילות הגברה של 90%-110% עם R2 ≥ 0.98. עם זאת, ddPCR כשיטת נקודת קצה היא בדרך כלל פחות רגישה מאשר qPCR בשל שונות ביעילות הגברה. לכל הפחות, מומלץ להפעיל שיפוע טמפרטורה תרמי בשלב החישול/הרחבה כדי לכסות טמפרטורות מעל ומתחת לטמפרטורות החישול הצפויות ולהעריך את הפרדת משרעת הגשם והפלורסנט בין צבירי הטיפות השליליות והחיוביות כפונקציה של טמפרטורה. אם סביבת העבודה מאפשרת, מומלץ שיהיו תחנות עבודה ייעודיות נפרדות להכנת מיקס אב, הוספת תבנית והגברה. במידת האפשר, יש להפריד אותם פיזית על ידי זרימת עבודה חד-כיוונית עם בקרות הנדסיות מובנות, כגון גישה מבוקרת ולחצי אוויר דיפרנציאליים, כדי להפחית את הסיכון לזיהום צולב ולתוצאות חיוביות שגויות. אם הדבר אינו אפשרי, יש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע זיהום צולב.
ישנם שני שלבים בפרוטוקול זה שעשויים להיראות יוצאי דופן למי שרגיל יותר לפיתוח בדיקת qPCR. הראשון הוא הכללת אנזים הגבלה בתמהיל המאסטר PCR. במהלך הגברה ddPCR, כל טיפה עוברת מחזור תרמי לנקודת הקצה. בבדיקה ממוטבת כראוי, התוצאה היא שתי אוכלוסיות של טיפות, קבוצה אחת מציגה רמה גבוהה באופן עקבי של אותות פלואורסצנטיים - החיוביים - וקבוצה אחרת מציגה באופן עקבי רמה נמוכה של אות פלואורסצנטי - השליליים. אם מתרחשת הפרעה ל-PCR, היא עלולה לבטל את הסנכרון של התחלת הגברה של PCR, וכתוצאה מכך הטיפה לא תגיע לרמת הגברה, ולכן נקודות קצה פלואורסצנטיות לא עקביות. במקרה זה, הטיפות יפוזרו בין השליליות לחיוביות, וכתוצאה מכך נוצרת תופעה הנקראת גשם ddPCR. זה יכול לגרום לכימות לא מדויק של היעד וליישום לא עקבי וסובייקטיבי של ערכי סף. המלצתנו לקבוע את הסף מעט מעל האות של NTC, מה שאמור למזער את השפעות הגשם בכימות הסופי מכיוון שכל הטיפות עדיין נחשבות חיוביות, גם אם לא מחזוריות לחלוטין לנקודת הקצה. ל-AAV יש מבנה משני מורכב ביותר, אשר בהתאם ליעד ההגברה, עלול להפחית את הנגישות לפריימרים ולבדיקות, וכתוצאה מכך הפרעות PCR ולכן גשם. הכללת אנזים ההגבלה בתערובת האב חותכת את המבנה המשני הזה כדי להגדיל את הגישה של הפריימרים והגשושיות, ומפחיתה את הגשם, מה שעשוי לשפר בכך את דיוק הבדיקה. ההשפעות של הכללת אנזים הגבלה בתגובת ddPCR תוארו בעבר25,32. ניתן להשתמש בכל אנזים הגבלה, כל עוד הוא מאושר שאינו חותך באזור הגברת המטרה. אין צורך בשלבי עיכול מקדים או בהרכבי חיץ חלופיים.
השלב החריג השני הוא הכנת דגימת הדמעות המכילה AAV. בפרוטוקול זה נעשה שימוש ביחס של 1:10 (או יותר) של דמעות ולאחר מכן הדגימה חומה. בדרך כלל, כאשר דמעות נאספות באמצעות צינור נימי, שהוא שיטת איסוף נפוצה, בממוצע כ 10.0 μL ניתן לאסוף33. הדילול מסייע לטפל בנפח הדגימה המוגבל ולספק מספיק חומר לבדיקת בארות כפולות. בעוד שזה מפחית את הגבול התיאורטי של זיהוי, הרגישות החזקה של ddPCR עדיין צריכה לגרום לזיהוי של כל למעט מספר קטן מאוד של חלקיקים וקטוריים. גישה זו גם יוצרת "גיבוי" היטב אם אחד מהם היה נכשל באופן בלתי צפוי. במקרה זה, או במקרים של נפח דגימה לא מספיק כדי להפעיל שתי בארות, שגיאת פואסון יכולה לשמש להערכת דיוק. יתר על כן, במקרים בהם הריכוז הוא מתחת לגבול הגילוי, זה יוצר הזדמנות למזג נתוני באר כדי לקבוע ריכוז. יש צורך לשחרר את וקטורי AAV מן capsids ויראלי עבור זיהוי ddPCR. כמה שיטות לכימות של AAV כללו שלב עיכול פרוטאינאז K כדי להסיר את הקפסיד הנגיפי34,35,36. לכל הסרוטיפים הטבעיים של AAV יש טמפרטורות התכה של כ -90 מעלות צלזיוס או פחות, כאשר רובם נופלים מתחת ל -80 מעלות צלזיוס; לכן, נראה שמדובר בהכללה מיותרת37. נראה כי חימום לבדו מספיק כדי לשחרר דנ"א וקטורי.
יתר על כן, ddPCR הוא בדרך כלל פחות רגיש מעכבי PCR שעשויים להיות נוכחים במדגם שעשוי להשפיע על בדיקת qPCR. אם שלב בידוד DNA ספציפי נכלל, זה ידרוש גם אימות ספציפי, אשר נמנע בפרוטוקול זה. הדגימות מדוללות לפני החימום עקב קינטיקה של דיפוזיה של הגנום הווקטורי בנוזל. במהלך תהליך החימום והקירור שלאחר מכן, גדילי החישה החיוביים והשליליים של גנום הדנ"א החד-גדילי יכולים להתלכד יחד וליצור מתווך דו-גדילי אם הריכוזים גבוהים מספיק. דילול לפני חימום מפחית את הריכוזים והופך את זה לבלתי סביר מבחינה מתמטית שמספיק מתווכים דו-גדיליים נוצרים כדי להשפיע לרעה על דיוק הכימות. יש לציין כי אסור שמקטעי DNA סינתטיים או פלסמידים ליניאריים המשמשים כבקרות איכות יעברו שלב חימום זה. מכיוון שמדובר בדו-גדילי, חימום יגרום להמרה למתווכים חד-גדיליים. לאחר חלוקה עצמאית של QC חד-גדילי אלה לטיפות, הדבר צפוי לגרום לעלייה כפולה בריכוז ה-QC ביחס לריכוז הנומינלי. לחלופין, אם רוצים לחמם QCs כדי לתקנן את השיטה, יש לקחת זאת בחשבון בבנייה מחדש ובהקצאה של ריכוז נומינלי.
לבסוף, בנוגע להכנת דגימות, פרוטוקולים רבים ממליצים גם על הכללת שלב טיפול DNase כדי להסיר כל DNA וקטורי לא קפסול. שלב זה הוא קריטי במקרים בהם לא רצוי לכמת DNA חופשי הקשור להכנת הווקטור (כגון במהלך כימות למטרות מינון). עם זאת, בהקשר של התפלגות ביולוגית ומחקרי ביו-שפיכה, בדרך כלל רוצים לדעת לאן עבר דנ"א וקטורי כלשהו, ללא קשר אם הוא עטוף או לא. לכן, מומלץ בדרך כלל לא לבצע שלב טיפול DNase במהלך מחקרים כאלה. אם נקבע כי יש צורך לכלול שלב DNase, שלב זה צריך להיות לפני דילול וחימום.
במאמר זה מוצגים נתונים המייצגים את הגישה להערכת הטווח הדינמי, הרגישות, הדיוק והדיוק של השיטה בהקשר של אימות מתאים למטרה ותואם לשיטות מעבדה טובות. היעדר ההנחיות הנוכחיות בנושא זה מותיר את מעבדות התיקוף לקבוע לעצמן קריטריונים לבדיקת יעדים, בהתאם לחשיבה הנוכחית בתעשייה. קבוצות שונות הציבו קריטריוני יעד גבוהים ונמוכים יותר מאלה ששימשו במחקר זה: 19,20,21,22,23,24,25. יש לבחור את קריטריוני בדיקת היעד, עד להגדרתם הנוקשה יותר, לפני התיקוף בהתבסס על היישומים הקליניים המיועדים של השיטה. בהתאם להחלטות במורד הזרם שיש לקבל על בסיס הנתונים, ייתכן שיהיה צורך ברמות גבוהות יותר של דיוק ודיוק. לעומת זאת, תוצאה חיובית לעומת שלילית פשוטה עשויה להספיק.
הגישה התייחסה גם להמלצות להערכת ספציפיות ואפקט מטריצה. שלולית של דמעות שנאספו מאנשים שלא טופלו לא הניבה תוצאה חיובית בבדיקה זו, בעוד שניתן היה לזהות את המטרה כאשר הווקטור נדקר לתוך הדמעות בריכוז גבוה ונמוך במסגרת שיעורי ההחלמה המומלצים. באופן אידיאלי, מטריצה המכילה וקטור אנדוגני (למשל, שנאספה בעקבות טיפול בווקטור נגיפי) תיכלל גם היא בהערכות אלה. עם זאת, אין זה סביר כי דגימות כאלה יהיו זמינות לשימוש בתיקוף. כדי להגביר את החוסן של התיקוף, ניתן להעריך בריכות מרובות של דמעות, או דמעות שנאספו ממגוון אנשים, כדי לקבוע אם מתרחש אפקט מטריצה ספציפי למטופל. לבסוף, מומלץ להעריך את היציבות. בתהליכי עבודה שבהם מיצוי דנ"א מתרחש מתוך המטריצה הביולוגית, ייתכן שיהיה צורך להעריך את יציבות הדגימה והדנ"א שחולץ. בתהליך עבודה זה, הדגימה נבדקת ישירות בבדיקה ללא צורך במיצוי DNA. לכן, בהתחשב בהערכת היציבות של שיטה זו, יש להעריך את יציבות דגימות הדמעות. בדרך כלל, מומלץ לבצע הערכות ספסל, מקרר, הקפאה/הפשרה ויציבות לטווח ארוך. אלה לא בוצעו במסגרת מחקר זה, אך ניתן להשתמש בשיטות שפותחו כאן בהערכה זו, לאחר מניפולציות לדגימות הקלט.
בסך הכל, שיטה זו הוכחה כבדיקה חזקה, חוזרת וניתנת לאימות לזיהוי וקטורים מבוססי AAV בדגימות דמעות. הוא עשוי לשמש כפלטפורמה להתאמה לווקטורים ספציפיים לתמיכה בניסויים קליניים ומספק בסיס לאימות של בדיקה העולה בקנה אחד עם שיטות מעבדה טובות.

הגדרות הטיפול הגנטי משתנות, אך בדרך כלל גורמות להחלפה קבועה מכוונת ולעתים קרובות צפויה של רצף דנ"א ספציפי של הגנום התאי כדי לשנות או לשנות את הביטוי של גן או לשנות את התכונות הביולוגיות של תא חי למטרה קלינית 1,2. וקטורים נגיפיים משמשים יותר ויותר ככלי לריפוי גנטי בשל יעילות ההתמרה שלהם, כאשר דו"ח אחד מציע כי מעל 70% מהניסויים הקליניים הנוכחיים בריפוי גנטי משתמשים בווקטורים נגיפיים3. העניין בווקטורים נגיפיים לריפוי גנטי הולך וצובר תאוצה. דו"ח הנתונים הרבעוני לרבעון 4 לשנת 2022 על נוף הטיפול בגנים, תאים ורנ"א של האגודה האמריקאית לתרפיה גנטית ותאית דיווח כי בשנת 2022, צנרת הטיפול בגנים, תאים ורנ"א מפרה-קליני לרישום מוקדם גדלה ב-7%, מה שמביא את המספר הכולל של טיפולים בפיתוח ל-3,726, מתוכם 2,053 (55%) טיפולים גנטיים4. מנהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר כיום 27 טיפולים תאיים וגנטיים לשימוש קליני בבני אדם, חמישה מהם משתמשים באופן ספציפי בווקטורים נגיפיים5.
וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) זכו להתעניינות ספציפית ככלי לריפוי גנטי. מטא-אנליזה שנערכה לאחרונה חשפה כי בשני העשורים האחרונים נערכו כ-136 ניסויים קליניים שחקרו את השימוש ב-AAVs6. בנוסף, שלושה מתוך חמשת הטיפולים הגנטיים שאושרו על ידי ה- FDA בארה"ב מבוססים על AAV. זאת בשל אופיים הניתן לעריכה ברמה גבוהה, טווח מארחים רחב שניתן לכוונן על בסיס שימוש בווקטורים ספציפיים המתרחשים באופן טבעי או מהונדסים באופן מלאכותי, פתוגניות נמוכה ורעילות בבני אדם, ואימונוגניות נמוכה בדרך כלל 7,8. AAVs שימשו בהצלחה גם לטיפול במחלות עיניים במסגרת קלינית מאושרת. Voretigene neparvovec-rzyl הוא טיפול מבוסס AAV2 שאושר על ידי ה- FDA האמריקאי בשנת 2017 ועל ידי סוכנות התרופות האירופית (EMA) בשנת 2018 לטיפול בניוון רשתית9 הקשור למוטציה ביאלית RPE65.
עם העניין הגובר בפיתוח טיפולים מבוססי AAV מגיע הצורך בהדרכה רגולטורית על בדיקות. זיהוי וכימות מדויקים של כל וקטור נגיפי הוא חלק בלתי נפרד משלבי הגילוי, הייצור והבדיקות הפרה-קליניות/קליניות של פיתוח המוצר. ה- FDA בארה"ב החל לפרסם כמה הנחיות לטיפולים גנטיים, כולל על הכימיה, הייצור והבקרה של ריפוי גנטי אנושי יישומי תרופות חדשות ניסיוניות 10, מעקב ארוך טווח לאחר מתן טיפול גנטי11, בדיקות רטרו-וירוס כשירות שכפול 12, והמלצות לווקטורים מיקרוביאליים המשמשים בטיפולים גנטיים 13. ה- EMA פרסם גם שורה של הנחיות הנוגעות לפיתוח מוצרי ריפוי גנטי שבדרך כלל מתיישרים עם המלצות ה- FDA, אם כי קיימים כמה הבדלים14. חשוב לציין כי בעוד שהנחיות אלה אינן קובעות אחריות הניתנת לאכיפה משפטית, למעט כאשר יש התייחסות לתקנות ספציפיות, הן מספקות בהירות לגבי החשיבה הנוכחית של רשויות רגולטוריות בנושא וציפיותיהן לבדיקות הנדרשות להגשת תרופות ואישור רגולטורי.
ה- FDA ממליץ באופן ספציפי כי יש לערוך מחקרים כדי להעריך את ההתפלגות, ההתמדה והפינוי של וקטור מאתר מתן כדי להתמקד ברקמות עיניים ולא עיניות, נוזלים תוך עיניים ודם15. אלה לובשים צורה של הפצה ביולוגית ומחקרי שפיכה. מחקרי הפצה ביולוגית מעריכים חשיפה על ידי חקירת האופן שבו מוצר מתפשט בכל גופו של המטופל מאתר הנטילה. שפיכה מעריכה באופן ספציפי את שחרור המוצר מהמטופל לסביבה ומעלה את האפשרות להעברת הווקטור לאנשים לא מטופלים16. ה-FDA ממליץ על תכנון מחקרי הפצה ביולוגית ושפיכה ביחס לתדירות איסוף הדגימות, משך איסוף הדגימות, סוגי הדגימות שנאספו ותנאי האחסון.
בנוסף, ה- FDA ממליץ על שימוש בתגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR, או PCR בזמן אמת) לזיהוי כמותי של גנומים וקטוריים בשל קלות הביצועים שלה, פורמט תפוקה גבוהה, זמני אספקה מהירים ורגישות לבדיקה. עם זאת, קיים מחסור יחסי בהמלצות לתכנון והערכת ביצועים של שיטות מולקולריות בהשוואה לאלה הקיימות עבור מולקולות קטנות וגדולות. רבות מההנחיות למחקרים כאלה קשות ליישום על שיטות מולקולריות בשל העיצוב הייחודי והמורכב הן של המוצרים והן של הבדיקות עצמן, מה שמעלה שאלות לגבי נאותות הפלטפורמות הזמינות להערכות המומלצות והשיטות המתאימות לאימות הבדיקה. עד כה, ה- FDA לא דרש אימות רשמי של בדיקות מבוססות PCR, אם כי EMA הטיל דרישה זו17. לאור חלל זה, קבוצות וסדנאות שונות פרסמו סקירות טכניות והמלצות שיצרנים וארגוני מחקר קבלניים ביקשו לעקוב אחריהם18,19,20,21,22,23,24,25. רוב ההמלצות הללו נכתבות במיוחד תוך התחשבות במבחני qPCR, עם הצעות או שינויים לפלטפורמות מתפתחות, כגון PCR דיגיטלי טיפתי (ddPCR), הכלולות רק כרלוונטיות. המלצות עדכניות יותר התמקדו בשיקולים של בדיקות ddPCR, אך התמקדו בעיקר ביישומן לכימות גנום וקטורי בסביבת ייצור ולא במטריצות ביולוגיות מורכבות בהן נתקלים במחקרי ביושפידינג.
בהתאם ליישום קליני ומטרות, ddPCR עשוי להיות מועדף על פני qPCR לתמיכה במחקרי הפצה ביולוגית ונשירה בשל הרגישות המוגברת של ddPCR ויכולתו להתמודד עם הפרעות מטריצה בהשוואה ל- qPCR. יתר על כן, בשל חלוקת הדגימות לכ-20,000 טיפות, ניתן להשיג כימות מדויק של מספר ההעתקה ללא שימוש בעקומה סטנדרטית באמצעות סטטיסטיקת פואסון, דבר המפשט את פיתוח השיטה ותיקוףה. מטרת פרוטוקול זה היא לתאר גישה סטנדרטית לפיתוח ותיקוף של שיטה מבוססת ddPCR לזיהוי וקטורי AAV בדמעות שנאספו מפני השטח של העין לתמיכה במחקרים קליניים של נשירה ביולוגית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AAV-eGFP Vector</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>RS-AAV2-FL</td>
			<td>Lot AAV2-0720-FL, used as a proof of principle vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Droplet Digital PCR system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>QX200</td>
			<td>Alternative ddPCR system may be used following manufacturer&#8217;s protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864110</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Buffer Control for Probes</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863052</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system and PCR chemistry.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Droplet Reader Oil</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863004</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Piercable Foil Seals</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1814040</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Plates 96-Well, Semi-Skirted</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>12001925</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (no dUTP)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1863023, 1863024, or 1863025</td>
			<td>Use master mix compatible with primers/probes and ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartidges</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>QX200</td>
			<td>Alternative ddPCR system may be used following manufacturer&#8217;s protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneAmp PCR Buffer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>N8080129</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9906</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Plate Sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>PX1</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for AutoDG</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>24040</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer and Hydrolysis Probes</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Design based on target sequence using general approaches for primer/probe design. Select fluorphores and quenchers compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restriction Enzyme</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Varies with target amplification sequence. Use restriction enzyme that does not cut in the amplified sequence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheared salmon sperm DNA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9680</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic DNA gene fragment or linearized plasmid</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td>Design a synthetic DNA fragment containing the target amplification region for use as a quality control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>T0224</td>
			<td>Ensure prepared or purchases nuclease free. 10 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH=8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>C1000</td>
			<td>Or use material compatible with ddPCR system.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a validatable droplet digital polymerase chain reaction assay for the detection of adeno-associated viral vectors in bioshedding studies of tears

השימוש בווקטורים נגיפיים לטיפול במחלות גנטיות גדל משמעותית בשנים האחרונות, עם למעלה מ-2,000 מחקרים שנרשמו עד כה. וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו (AAV) מצאו הצלחה מיוחדת בטיפול במחלות הקשורות לעיניים, כפי שהודגם באישור של voretigene neparvovec-rzyl. כדי להביא טיפולים חדשים לשוק, סוכנויות רגולטוריות בדרך כלל מבקשות מחקרי ביושפידינג מוסמכים או מתוקפים כדי להעריך את שחרור הווקטור לסביבה. עם זאת, לא פורסמו הנחיות רשמיות לפיתוח בדיקות מבוססות מולקולרית לתמיכה במחקרי נשירה כאלה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי, מה שמשאיר את המפתחים לקבוע שיטות עבודה מומלצות עבור עצמם. מטרת פרוטוקול זה היא להציג פרוטוקול תקף לזיהוי וקטורי AAV בדמעות אנושיות על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית (ddPCR) לתמיכה במחקרי ביושפיכה קליניים. כתב יד זה דן בגישות הנוכחיות בתעשייה לאימות בדיקות מולקולריות ומדגים כי השיטה חורגת מקריטריוני הקבלה של מבחני היעד המוצעים כיום בסקירות טכניות. לבסוף, צעדים קריטיים בביצועים של כל מבחן ddPCR, ללא קשר ליישום, נדונים.

Gene therapy definitions vary, but generally induce an intentional and often expected permanent alternation of a specific DNA sequence of the cellular genome to modify or manipulate the expression of a gene or to alter the biological properties of a living cell for a clinical purpose1,2. Viral vectors are increasingly being used as vehicles for gene therapy due to their efficiency of transduction, with one report suggesting that over 70% of current gene therapy clinical trials utilize viral vectors3. Interest in viral vectors for gene therapy has been gaining steadily. The Quarter 4 2022 Quarterly Data Report on the Gene, Cell, and RNA therapy landscape from the American Society of Gene and Cell Therapy reported that in 2022, the gene, cell, and RNA therapy pipeline from preclinical to pre-registration grew by 7%, bringing the total number of therapies in development to 3,726, of which 2,053 (55%) were gene therapies4. The United States Food and Drug Administration (USA FDA) currently has approved 27 cell and gene therapies for clinical use in humans, five of which specifically utilize viral vectors5.
Adeno-associated viruses (AAVs) have gained specific interest as vehicles for gene therapy. A recent meta-analysis revealed that there have been approximately 136 clinical trials investigating the use of AAVs in the past two decades6. Additionally, three of the five USA FDA approved gene therapies are AAV based. This is due to their highly editable nature, broad host range that can be tuned based on the use of specific naturally occurring or artificially engineered vectors, low pathogenicity and toxicity in humans, and generally low immunogenicity7,8. AAVs have also been successfully used to treat ocular diseases in an approved clinical setting. Voretigene neparvovec-rzyl is an AAV2-based therapy that was approved by the USA FDA in 2017 and by the European Medicines Agency (EMA) in 2018 to treat biallelic RPE65 mutation-associated retinal dystrophy9.
With increasing interest in the development of AAV-based therapies comes the need for regulatory guidance on assays. Accurate detection and quantification of any viral vector is an integral part of the discovery, manufacturing, and preclinical/clinical testing phases of product development. The USA FDA has begun to issue some guidance for gene therapies, including on the chemistry, manufacturing, and control for human gene therapy investigational new drug applications10, long-term follow-up after administration of gene therapy11, replication-competent retrovirus testing12, and recommendations for microbial vectors used in gene therapies13. The EMA has also released a series of guidelines concerning the development of gene therapy products that generally align with the FDA recommendations, though some differences do exist14. It is important to note that while these guidance do not establish legally enforceable responsibilities, except where specific regulations are referenced, they provide clarity on the current thinking from regulatory agencies on the topic and their expectations for assays required for drug filings and regulatory approval.
The FDA specifically recommends that studies should be conducted to assess the distribution, persistence, and clearance of a vector from the site of administration to target ocular and non-ocular tissues, intraocular fluids, and blood15. These take the form of biodistribution and shedding studies. Biodistribution studies evaluate exposure by investigating how a product is spread throughout a patient&#39;s body from the site of administration. Shedding specifically evaluates the release of the product from the patient into the environment and raises the possibility of transmission of the vector to untreated individuals16. The FDA makes recommendations for the design of biodistribution and shedding studies with respect to the frequency of sample collection, duration of sample collection, types of samples collected, and storage conditions.
Additionally, the FDA recommends the use of quantitative polymerase chain reaction (qPCR, or real-time PCR) for the quantitative detection of vector genomes due to its ease of performance, high-throughput format, rapid turnaround times, and assay sensitivity. However, there is a relative lack of recommendations for the design and performance assessment of molecular methods compared to those which exist for small and large molecules. Many of the guidelines for such studies are difficult to apply to molecular methods due to the unique and complex design of both the products and the assays themselves, raising questions as to the appropriateness of the available platforms for the recommended assessments and appropriate methods for assay validation. To date, the FDA has not required formal validation of PCR-based assays, though the EMA has imposed this requirement17. In light of this void, different groups and workshops have issued white papers and recommendations that manufacturers and contract research organizations have sought to follow18,19,20,21,22,23,24,25. Most of these recommendations are written specifically with qPCR assays in mind, with suggestions or alterations for emerging platforms, such as droplet digital PCR (ddPCR), included only as deemed relevant. More recent recommendations have focused on considerations for ddPCR assays, but have largely focused on their applications to vector genome quantification in a manufacturing setting rather than in the complex biological matrices encountered in bioshedding studies.
Depending on clinical application and goals, ddPCR may be preferred over qPCR in support of biodistribution and shedding studies due to ddPCR&#39;s increased sensitivity and ability to handle matrix interference compared to qPCR. Furthermore, due to the partitioning of samples into approximately 20,000 droplets, accurate quantification of the copy number can be achieved without the use of a standard curve using Poisson statistics, simplifying the method development and validation. The goal of this protocol is to describe a standardized approach for the development and validation of a ddPCR-based method for the detection of AAV vectors in tears collected from the ocular surface in support of clinical bioshedding studies.

זרקור המחבר: התמודדות עם פערי רגולציה במחקרים מולקולריים על ידי כימות וקטורים נגיפיים במטריצות מורכבות 

בדיקת תגובת שרשרת של פולימראז דיגיטלי טיפתי לזיהוי וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו במחקרי שפיכה ביולוגית של דמעות

Our protocol quantifies adeno-associated viral vectors in complex matrices. Accurate detection and quantification are essential to assessing their performance in clinical trials. This protocol specifically seeks to fill the current regulatory gaps in the design of good laboratory practices'compliant molecular studies.As a part of viral vector development, regulatory agencies require the assessment of vector bio-shedding. ddPCR is a promising technology for this assessment as it allows for accurate quantification without the use of a standard curve and improved sensitivity compared to qPCR. Accurate quantification in the complex matrices encountered in clinical settings, such as tears, can be challenging to validate due to PCR interference and inhibition.Limited clinical sample amounts can also limit the ability to detect rare events if the assay is not sufficiently sensitive. Our approach develops a repeatable and adaptable ddPCR-based framework to validate assays for use in regulated studies. This method avoids a specific DNA extraction step, allowing for more streamlined validation and provides clear criteria against which to evaluate assay performance to ensure robustness and repeatability.This protocol has the potential to be applied to any viral vector shedding study, not just the detection of AAV in tears, as presented here. It creates a robust and repeatable framework upon which multiple fit-for-purpose, regulated programs can be developed.

למטרות הדגמה, פותחה בדיקה שנועדה לזהות וקטור AAV2 בעל חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP), עם מקטע DNA סינתטי דו-גדילי המכיל eGFP כבקרת איכות. נכון לעכשיו, יש ויכוח מתמשך האם הווקטור עצמו או מקטע DNA סינתטי או פלסמיד ליניארי הוא המתאים ביותר לשימוש כמו QC. באופן כללי, ניתן להשתמש במקטע DNA סינתטי או פלסמיד ליניארי אם מודגמת שקילות לווקטור בפיתוח השיטה (הנתונים אינם מוצגים). פריימרים וגשושיות תוכננו ועברו אופטימיזציה לזיהוי טרנסגן eGFP. עיין בטבלה משלימה S1 עבור הרצפים המשמשים בעבודה זו. ריכוז מלאי שברי QC נקבע אמפירית באמצעות ddPCR. כל הבדיקות בוצעו תוך שימוש בריכוזים ובתנאי PCR שניתנו כדוגמאות בסעיף הפרוטוקול.
עבור בדיקות qPCR, מומלץ להעריך את הלינאריות, הרגישות, הטווח הדינמי, הדיוק והדיוק של העקומה הסטנדרטית. מכיוון ש- ddPCR אינו מסתמך על עקומה סטנדרטית לכימות היעד, יש לשנות המלצות אלה. במקום זאת, QCs המורכבים ממקטעי DNA סינתטיים דו-גדיליים המדוללים לריכוזים שונים כדי להתפרש על הטווח הצפוי לכימות של תגובת ddPCR בהתבסס על המידול הסטטיסטי של פואסון שימשו 29,30,31,32 כדי להגדיר את הטווח הדינמי והרגישות ולהעריך דיוק ודיוק. הבחירה בריכוזי QC התבססה בעיקר על היחס הצפוי בין טיפות חיוביות לסך כל הטיפות בתוך באר בריכוז נתון. מבחינה מתמטית, ddPCR הוא תיאורטית המדויק ביותר כאשר כ -80% מהמחיצות מגבירות באופן חיובי. ככל שהיחס החיובי לסך הטיפות עולה מעל 0.8, הדיוק יורד עקב הרוויה של המחיצות, כאשר כימות אינו אפשרי ברגע ש-100% מהטיפות חיוביות. בקצה הנמוך, תיאורטית, ניתן לזהות ולכמת טיפה חיובית אחת בלבד, אם כי הדיוק גרוע יותר והבדיקה כפופה לתוצאות חיוביות שגויות ברמה נמוכה. בדרך כלל, לפחות שלוש טיפות חייבות להיות חיוביות כדי שתוצאה תחושב בביטחון של 95%, שהוא הסף לחישוב ריכוז שבו השתמשנו כאן.
הוכנה סדרה של חמישה ריכוזי QC שונים, כאשר מספר העתק היעד / נפחי תגובת PCR μL חושבו צפויים להניב יחס חיובי לסך הטיפות המשתרע על פני הטווח הניתן לכימות של ddPCR, כפי שמוצג בטבלה 5. אלה שימשו להערכת הדיוק והדיוק של הבדיקה. בהערכה כאן, הגבולות העליונים והתחתונים של הכימות לא נדחקו למקסימום התיאורטי האפשרי ב- ddPCR. כימות מדויק עשוי להיות אפשרי ברמות גבוהות ונמוכות יותר ממה שהודגם כאן. יש לפתח את הטווח בהתאם ליישומים במורד הזרם של שיטה זו.
בסך הכל הוכנו שלוש סדרות דילול עצמאיות של QC אלה במאגר דילול דגימה עבור כל אצווה כדי להעריך את הדיוק והדיוק תוך כדי בדיקה. נכללו בארות כפולות של כל דילול QC. כדי לדמות פרוטוקול אימות בפועל, בוצעו בסך הכל שש אצוות דיוק ודיוק על ידי אנליסטים מרובים במשך מספר ימים. התוצאות משש אצוות אלה נותחו כדי להגדיר את הדיוק והדיוק של השיטה תוך המבחן וכדי להגדיר את הטווח הדינמי של הבדיקה.
הביצועים בתוך הבדיקה הוערכו עבור כל אצווה בכל רמת QC. ציפינו שבכל בארות ה-QC וה-NTC יהיו לפחות 10,000 טיפות. נתון זה הושג ב-216 מתוך 216 בארות שנבדקו בכל שש האצוות, עם ספירת טיפות ממוצעת של 19,748 טיפות לבאר (טבלה 6). לאחר מכן, %CV בין בארות של כל קבוצה של בארות כפולות של כל QC היה צפוי להיות ≤25.0%, למעט QC הגבול העליון והתחתון, שם ≤30.0% היה צפוי. זה הושג בקבוצות של 90 מתוך 90 בארות שנבדקו בכל שש האצוות עבור QC, עם %CV ממוצע בין בארות של 3.9% בכל רמות ה- QC (טבלה 7). כל ה-QC הניבו יחס טיפתי ממוצע חיובי לסך כל הטווחים הצפויים שתוארו לעיל (טבלה 6).
בתוך כל אצווה חושבו הממוצע התוך-מבחני וסטיית התקן עבור כל אחת מנקודות סדרת הדילול שהוכנו באופן עצמאי, ואלה שימשו לחישוב ממוצע תוך-בדיקה עבור כל ריכוז בכל בדיקה. זה שימש כדי להעריך את הדיוק והדיוק של הבדיקה (טבלה 8). דיוק מתייחס לשונות בנתונים מעותקים משוכפלים של אותו מדגם הומוגני בתנאי בדיקה רגילים ומוערך על ידי חישוב %CV של האליציטוטים המרובים הכלולים. ציפינו ששלושת האליציטוטים שנבדקו בכל אצווה יניבו %CV תוך בדיקה ≤25.0%, למעט QC הגבול העליון והתחתון שבו ≤30.0% היה צפוי. זה הושג עבור כל חמש רמות QC בכל אחת מ -60 קבוצות (30 מתוך 30 ביצועים בסך הכל). באופן כללי, ניתן להשיג דיוק תוך מבחני גבוה יותר מקריטריוני היעד, עם ממוצע של %CV תוך בדיקה של 7.7% בכל רמות ה- QC. דיוק מתייחס לקרבת ההסכמה בין הערך שנקבע בניסוי לבין הערך הנקוב. זה מוערך על ידי חישוב אחוז השגיאה היחסית (%RE, או %Bias) בין הריכוזים המחושבים של כל QC לבין הריכוזים הנומינליים הצפויים באופן תיאורטי. היה צפוי כי הממוצע תוך המבחן של שלושת aliquots יהיה ±25.0% RE של הריכוז הנומינלי, למעט QC הגבול העליון והתחתון שבו ±30.0% היה צפוי. זה הושג עבור כל חמש רמות QC בכל אחת מ -60 קבוצות (30 מתוך 30 ביצועים בסך הכל). באופן כללי, ניתן להשיג דיוק תוך-מבחני גדול יותר מהיעד שלנו, עם ממוצע מוחלט של %RE בתוך הבדיקה של 4.2% בכל רמות ה-QC. בכל הביצועים של NTC (30 בסך הכל), לא ניתן היה לזהות טיפות חיוביות.
דיוק ודיוק בין בדיקות חושבו גם באמצעות הממוצע תוך כדי בדיקה של כל רמת QC בתוך כל אצווה. הדיוק בין הבדיקות היה צפוי להיות ≤25.0% CV, למעט QC הגבול העליון והתחתון שבו ≤30.0% היה צפוי. כמו כן, עבור דיוק בין מבחנים, ±25.0% RE היה צפוי, למעט QC הגבול העליון והתחתון שבו ±30.0% היה צפוי. נצפו דיוק ודיוק גבוהים משמעותית ממטרות אלה (לוח 9), עם דיוק בין הבדיקות הנע בין 4.0% ל-8.5% ודיוק מוחלט בין 1.0% ל-3.2%. באופן קולקטיבי, תוצאות אלה מראות כי שיטה זו יכולה להשיג דיוק ודיוק תוך ובין-מבחנים מספיקים היטב ביעדי התעשייה הנוכחיים. טווח דינמי של בדיקה זו של 2,500-2.5 עותקים לכל מיקרוליטר של תגובת PCR יכול להיות מוגדר על סמך תוצאות אלה, עם רגישות בדיקה כוללת של 2.5 עותקים לכל μL של תגובת PCR. כאמור, ייתכן שניתן יהיה לאמת טווחים דינמיים רחבים יותר.
לאחר מכן, היה צורך להעריך את דיוק הבדיקה ואת הדיוק בתוך מטריצת היעד - במקרה זה, דמעות. בדרך כלל, בדיקות מאומתות לפני תחילת מחקרים קליניים, כלומר דמעות שנאספו מחולים שטופלו בווקטורים לא צפויות להיות זמינות למטרות תיקוף. זה יכול להיווצר באופן מלאכותי על ידי זינוק וקטור המטרה AAV לתוך דמעות שנאספו מתורמים מתנדבים כדי ליצור QCs קוצים מטריצה. דמעות אנושיות מצטברות נאספו על ידי צד שלישי (BioIVT). לצורך הוכחת עיקרון, נעשה שימוש בווקטור AAV2 המבטא eGFP שנרכש ממקור מסחרי. ריכוז מלאי וקטור AAV2 נקבע אמפירית באמצעות ddPCR, ללא שימוש בשלב בידוד DNA, כמתואר בפרוטוקול זה. בכל ריצה, ה-AAV2 הוזנק באופן עצמאי לשלושת אליציטוטי הדמעות ברמה גבוהה (צפי לתגובת PCR של 1.41 x 103 עותקים/μL) ונמוכה (תגובת PCR של 28.2 עותקים / μL PCR). aliquots unspiked נכללו כבקרה כדי להדגים את הספציפיות של השיטה.
הביצועים בתוך הבדיקה הוערכו עבור כל אצווה בכל רמת ספייק. היה צפוי שבכל דגימות הדמעות יהיו לפחות 10,000 טיפות. זה הושג ב-108 מתוך 108 בארות שנבדקו בכל שש האצוות, עם מספר טיפות כולל ממוצע של 20,208 טיפות לבאר (טבלה 10). לאחר מכן, %CV בין בארות של כל קבוצה של בארות כפולות של כל QC היה צפוי להיות ≤25.0% עבור רמות הזינוק הגבוהות והנמוכות. נתון זה הושג ב-36 מתוך 36 קבוצות של בארות שנבדקו בכל שש האצוות עבור ה-QC, עם ממוצע של %CV בין בארות של 3.2% (טבלה 11).
בתוך כל אצווה חושבו הממוצע התוך-מבחני וסטיית התקן עבור כל אחד מדוקרנים הדמעות שהוכנו באופן עצמאי, ואלה שימשו לחישוב ממוצע תוך-בדיקה עבור כל ריכוז בכל בדיקה. זה שימש כדי להעריך את הדיוק והדיוק של הבדיקה במטריצה (טבלה 12). ציפינו ש%CV תוך כדי בדיקה יהיה ≤25.0% ורמות זינוק גבוהות ונמוכות. זה הושג בשש מתוך שש קבוצות עבור כל רמה. באופן כללי, ניתן להשיג דיוק תוך-מבחני גדול יותר במטריצה מאשר היעד, עם ממוצע תוך מבחן %CV של 3.7% ברמה הגבוהה ו-12.2% ברמה הנמוכה (סה"כ 8.0%). כמו כן, היה צפוי כי %RE בתוך המבחן יהיה ±25.0% בשתי רמות הזינוק. זה הושג בשש מתוך שש קבוצות עבור כל רמה. כמו כן, נמצא באופן כללי כי ניתן להשיג דיוק תוך-מבחני גבוה יותר במטריצה מאשר היעד, עם %RE מוחלט ממוצע תוך מבחני של 8.1% ברמה הנמוכה ו-11.3% ברמה הגבוהה (סה"כ 9.7%). עבור הבקרה ללא קוצים, לא ניתן היה לזהות אות eGFP באף אחד מהאליציטוטים (טבלה 12), מה שמדגים את הספציפיות של השיטה במטריצת הדמעות האנושית.
דיוק ודיוק בין בדיקות במטריצת דמעות חושבו גם הם באמצעות הממוצע התוך-מבחני של כל רמת ספייק בתוך כל אצווה. היה צפוי שהדיוק בין הבדיקות יהיה ≤25.0% קורות חיים, ועבור דיוק בין מבחנים, ציפינו ל±25.0% RE. נצפתה רמת דיוק ודיוק גבוהה משמעותית ממטרות אלה (לוח 13), עם דיוק בין-מבחני של 5.5% ברמה הגבוהה ו-7.1% ברמה הנמוכה, ודיוק מוחלט של 11.3% ברמה הגבוהה ו-8.1% ברמה הנמוכה. יחד, תוצאות אלה מדגימות את הדיוק, הדיוק והספציפיות של השיטה במטריצת דמעות.
טבלה 5: בקרות איכות המשמשות להגדרת הטווח הדינמי של הבדיקה. קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%205.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 6: ספירת טיפות כוללת ויחס חיובי לסך הטיפות של בקרת איכות DNA סינתטי דו-גדילי ו-NTC. קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%206.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 7: סטטיסטיקות QC בין בארות (יעדי העתקה/תגובת PCR μL). קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%207.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 8: דיוק ודיוק תוך כדי בדיקה של QC (יעדי העתקה/תגובת PCR μL). קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%208.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 9: דיוק ודיוק בין בדיקות של QC (מטרות העתקה/תגובת PCR μL). קיצורים: ULQC = בקרת איכות גבול עליון; HQC = בקרת איכות גבוהה; MQC = בקרת איכות בינונית; LQC = בקרת איכות נמוכה; LLQC = בקרת איכות גבול תחתון; NTC = ללא פקד תבנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%209.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 10: ספירת טיפות כוללת של דגימות דמעות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2010.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 11: סטטיסטיקה בין בארות של דגימת דמעה (מטרות העתקה/תגובת PCR μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2011.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 12: דיוק תוך בדיקה ודיוק של דגימות דמעות (מטרות העתקה/תגובת PCR μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/Longacre%20Table%2012.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 13: דיוק ודיוק בין בדיקות של דגימות דמעות (מטרות העתקה/תגובת PCR μL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Table%2013.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה S1: רצפים של פריימר, בדיקות ובקרת איכות DNA סינתטי דו-גדילי שנעשה בהם שימוש במחקר זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65495/65495_Longacre%20Supp.%20Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Addressing Regulatory Gaps in Molecular Studies by Quantifying Viral Vectors in Complex Matrices at JoVE.com

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפיתוח ותיקוף של שיטות מעבדה טובות בזיהוי תואם של וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו בדמעות אנושיות על ידי תגובת שרשרת פולימראז דיגיטלית טיפתית לתמיכה בפיתוח קליני של וקטורים של ריפוי גנטי.

The use of viral vectors to treat genetic diseases has increased substantially in recent years, with over 2,000 studies registered to date. ...

הפרוטוקול שלנו מכמת וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו במטריצות מורכבות. זיהוי וכימות מדויקים חיוניים להערכת הביצועים שלהם בניסויים קליניים. פרוטוקול זה מבקש באופן ספציפי למלא את הפערים הרגולטוריים הנוכחיים בתכנון מחקרים מולקולריים תואמי שיטות מעבדה טובות.כחלק מפיתוח וקטורים ויראליים, רשויות רגולטוריות דורשות הערכה של נשירה ביולוגית וקטורית. ddPCR היא טכנולוגיה מבטיחה להערכה זו מכיוון שהיא מאפשרת כימות מדויק ללא שימוש בעקומה סטנדרטית ורגישות משופרת בהשוואה ל- qPCR. כימות מדויק במטריצות המורכבות בהן נתקלים במסגרות קליניות, כגון דמעות, יכול להיות מאתגר לאימות עקב הפרעות ואינהיביציה של PCR.כמויות דגימה קליניות מוגבלות יכולות גם להגביל את היכולת לזהות אירועים נדירים אם הבדיקה אינה רגישה מספיק. הגישה שלנו מפתחת מסגרת מבוססת ddPCR הניתנת לחזרה ולהתאמה כדי לאמת בדיקות לשימוש במחקרים מוסדרים. שיטה זו מונעת שלב ספציפי של מיצוי DNA, מאפשרת אימות יעיל יותר ומספקת קריטריונים ברורים שמולם ניתן להעריך את ביצועי הבדיקה כדי להבטיח עמידות וחזרתיות.לפרוטוקול זה יש פוטנציאל להיות מיושם בכל מחקר של שפיכת וקטורים ויראליים, לא רק בזיהוי AAV בדמעות, כפי שמוצג כאן. היא יוצרת מסגרת חזקה וחוזרת על עצמה שעליה ניתן לפתח מספר תוכניות מותאמות למטרה ומוסדרות.

a-validatable-droplet-digital-polymerase-chain-reaction-assay-for

Research

JoVE Journal

Biology

A Validatable Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Adeno-Associated Viral Vectors in Bioshedding Studies of Tears

1.3K Views.  KCAS Bioanalytical and Biomarker Services. הפרוטוקול שלנו מכמת וקטורים נגיפיים הקשורים באדנו במטריצות מורכבות. זיהוי וכימות מדויקים חיוניים להערכת הביצועים שלהם בניסויים קליניים. פרוטוקול זה מבקש באופן ספציפי למלא את הפערים הרגולטוריים הנוכחיים בתכנון מחקרים מולקולריים תואמי שיטות מעבדה טובות.כחלק מפיתוח ו?...

Video: זרקור המחבר: התמודדות עם פערי רגולציה במחקרים מולקולריים על ידי כימות וקטורים נגיפיים במטריצות מורכבות 

The use of viral vectors to treat genetic diseases has increased substantially in recent years, with over 2,000 studies registered to date. Adeno-associated viral (AAV) vectors have found particular success in the treatment of eye related diseases, as exemplified by the approval of voretigene neparvovec-rzyl. To bring new therapies to market, regulatory agencies typically request qualified or validated bioshedding studies to evaluate release of the vector into the environment. However, no official guidelines for the development of molecular based assays to support such shedding studies have been released by the United States Food and Drug Administration, leaving developers to determine best practices for themselves. The purpose of this protocol is to present a validatable protocol for the detection of AAV vectors in human tears by droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) in support of clinical bioshedding studies. This manuscript discusses current industry approaches to molecular assay validation and demonstrates that the method exceeds the target assay acceptance criteria currently proposed in white papers. Finally, steps critical in the performance of any ddPCR assay, regardless of application, are discussed.

Here, we present a protocol for the development and validation of good laboratory practices in the compliant detection of adeno-associated viral vectors in human tears by droplet digital polymerase chain reaction in support of clinical development of gene therapy vectors.

A Standardized Method for Detecting AAV Vectors in Human Tears Using ddPCR

To begin, take the thawed droplet digital, or ddPCR master mix and add probes, forward primer, and reverse primer to it at room temperature. Prepare the master mix for each amplification target following the suggested composition shown on the screen, and adjust the concentrations of primers and probes as needed. Vortex the mixture thoroughly and briefly centrifuge it in a mini centrifuge.Add the restriction enzyme and invert to mix. Next, add 16.5 microliters of the prepared master mix to each well of a PCR plate and seal the plate with a transparent adhesive film. Using the sample dilution buffer as the diluent, prepare quality control, or QC dilutions as outlined in this table which represents the recommended concentrations for a validation accuracy and precision run.Dilute the tear samples with a sample dilution buffer at a 1-to-10 ratio in 0.2-milliliter PCR tubes and seal the tubes. Heat the samples in a thermocycler at 95 degrees Celsius for 10 minutes and then at 4 degrees Celsius for at least 5 minutes. Remove the adhesive film from the ddPCR plate containing the master mix and add 5.5 microliters of QC dilution to appropriate wells of the 96-well plate as shown in the plate map.Then add 5.5 microliters of sample to the wells. Add 5.5 microliters of sample dilution buffer to the no template control, or NTC wells. Dilute 2x ddPCR buffer control at a 1-to-2 ratio using nuclease-free water and add 22 microliters of the buffer to any empty wells of a column.Add a pierceable foil seal to the plate and place the plate in the plate sealer. Seal the plate for 5 seconds at 180 degrees Celsius. Vortex the plate at the maximum speed for at least 30 seconds and centrifuge briefly in a plate spinner.On the touchscreen of the Automated Droplet Generator, select the columns on the plate map containing the samples. The deck of the instrument will light up to indicate which consumables are required. Load the droplet generator from back to front.The yellow light will change from yellow to green to indicate the sufficiency of the consumables. Place a cold block and the droplet plate holder. Ensure the block is fully blue colored and no pink is visible.Place a new 96 weld ddPCR plate in the cold block. Place the prepared PCR plate in the sample plate holder. Close the machine lid, and press start for droplet generation.Within 30 minutes, remove the plate containing the droplets from the cold block. Add a pierceable foil seal to the plate and place the plate in the plate sealer. Seal it for five seconds at 180 degrees Celsius.Then place the plate in a compatible thermal cycler and enter the cycling conditions shown on the screen. Load the plate into the droplet reader ensuring sufficient reader oil remains and the waste container has sufficient space. Finally, press the read button on the software to start reading the droplets.An intra assay mean for each concentration in each assay was calculated and this was used to assess the precision and accuracy of the assay. A mean inter-assay precision of 7.7%and a mean absolute inter-assay accuracy of 4.2%were found across all QC levels. Inter-assay accuracy and precision were also calculated using the inter-assay mean of each QC level within each batch.An inter-assay precision ranging from 4-to-8.5%and an inter-assay absolute accuracy ranging from one to 3.2%were found. Similarly, for the tear sample a mean inter-assay precision of 3.7%at the high spike level and 12.2%at the low spike level and a mean inter-assay absolute accuracy of 11.3%at the high level and 8.1%at the low level were observed. In the case of inter assay calculation, a precision of 5.5%at the high level and 7.1%at the low level and an absolute accuracy of 11.3%at the high level and 8.1%at the low level were found.