הניחו את שלפוחית הנבט המטופלת באטופוסיד, או GV, בצלחות תרבית פלסטיק שונות עם חיץ PFA-Tx 100 למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הביציות בשלושה מאגרי שטיפה נפרדים של 50 מיקרוליטר בטמפרטורת החדר והניחו אותן בחיץ חוסם של 25 מיקרוליטר על בלוק חם למשך שעה. לאחר מכן, להכין את הנוגדן העיקרי המזהה גמא H2AX.
לדלל את הנוגדן הראשוני עם החיץ החוסם ביחס של אחד עד 200 ולטבול את הביציות בטיפות של 15 מיקרוליטר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. שטפו את הביציות בשלושה מאגרי כביסה שונים של 50 מיקרוליטר. הכינו את הנוגדן המשני Alexa Fluor 488 conjugated growth anti-rabbit.
לאחר דילול עם החיץ החוסם, לטבול את הביציות בטיפות של 15 מיקרוליטר של הנוגדן למשך שעה על בלוק חם של 37 מעלות צלזיוס המוגן מפני אור. קחו צבע דנ"א פלואורסצנטי אדום רחוק DRAQ7 והעבירו אליו את הביציות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך לפני שתשטפו אותן בשלושה מאגרי כביסה שונים. הוסיפו טיפות קטנות של חיץ כביסה לביציות בצלחת פטרי בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ למיקרוסקופ קונפוקלי.
הפעל את בקר הלייזר ואת הלייזרים במערכת הקונפוקלית. לאחר הפעלת בקר המיקרוסקופ והמנורות, פתח את תוכנת הקונפוקל ובחר בעדשת שמן 40X. הניחו את המנה עם הביציות במחזיק הדגימה ונסו להתמקד בביציות על ידי הזזת הבמה על צירי X, Y ו-Z באמצעות הג'ויסטיק.
הגדר את עוצמת הלייזר, את הרווח ואת גודל חור הסיכה בנפרד עבור כל ניסוי כדי למזער כל רוויה. עבור כל ביצית, הגדר את אזור העניין הספציפי בגרעין באזור ה- DNA. הגדירו את גבולות אזור הדנ"א והתאימו את גודל צעד Z לשלושה מיקרומטרים.
לאחר מכן התחל בסריקה. שמרו את התמונות לכל תא בתיקייה שנבחרה. פתח את תוכנת ImageJ ולחץ על תמונה, ואחריה צבע, וערוצים מפוצלים.
כדי לפצל את כל הערוצים. לחץ על טבלת בדיקת מידע ובחר את הצבעים המועדפים עבור כל ערוץ לחץ על תמונה, צבע ומיזוג ערוצים כדי למזג את הערוצים עבור גמא H2AX ו- DNA. בביציות הגרעין המוקפות עם רמות גבוהות של נזק לדנ"א, לחץ על תמונה, ערימות, פרויקט Z, ובעזרת הפקודה בחירות ביד חופשית, בחר את כל אזור ה- DNA.
לחץ על ניתוח, ואחריו למדוד את פלואורסצנטיות גמא H2AX ולהעתיק את המדידות לקובץ Excel. פלואורסצנטיות גמא H2AX בביציות בשלב GV של הגרעין המוקף אפס שעות לאחר הטיפול באטופוסיד מוצגת באיור זה. הגמא H2AX עולה מיד לאחר החשיפה בכל ריכוזי האטופוזידים, והעלייה תלויה בריכוז.
פלואורסצנטיות גמא H2AX בביציות בשלב GV של הגרעין המוקף 20 שעות לאחר הטיפול באטופוסיד מוצגת כאן. גמא H2AX מפחית 20 שעות לאחר החשיפה בכל ריכוזי האטופוסידים. לאחר מעצר שלב ממושך, הביציות בשלב GV הראו את היכולת להפחית את מספר מוקדי הגמא H2AX ואת עוצמתם, מה שמרמז על נוכחות של תהליכי תיקון פעילים בביציות שנעצרו.
