כדי להתחיל, להכין את הציוד על ידי הפעלת respirometer ברזולוציה גבוהה ולחבר אותו לתוכנת respirometry VatLab לרכישת נתונים וניתוח. החלף את 70% אתנול בתא oxygraph עם מים מזוקקים כפול. בעזרת מוט ערבוב מגנטי, מערבבים אותו ברציפות במהירות 750 סל"ד בתא.
תן לו לעמוד במשך 10 דקות ולאחר מכן לשאוף את המים. שטפו את החדר שלוש פעמים במים מזוקקים פעמיים במשך חמש דקות כל אחת. כדי לכייל את חיישני החמצן, תחילה הסר את המים המזוקקים הכפולים ואת פיפטה שני מיליליטר של מדיום הכנת התא לתוך התא.
מניחים את הפקקים ומשאירים בועת חילופי אוויר. כדי להקליט את ערכי כיול החמצן, התאם את ההגדרות כגון רווח לחיישן, מתח קיטוב ומרווח רישום נתונים. לאחר מכן תייגו את הניסוי והזינו את המדיום.
לחץ על הפריסה ובחר 01 Calibration Experiment GR3 Temp. ערבב את המדיום עם מוט הערבוב במהירות 750 סל"ד למשך 30 דקות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס, ועקוב אחר ביצועי קרום החיישן. לחיצה ממושכת על לחצן העכבר השמאלי ועל מקש Shift, גרור את העכבר כדי לבחור אזור שבו השינוי בריכוז החמצן יציב.
לאחר מכן לחץ על oxygraph ולאחר מכן כיול O2. בכיול אוויר, שנה את הסימון שנבחר לאזור שנבחר קודם לכן. לאחר מכן לחץ על כיול והעתק ללוח.
עצור את ההקלטה ושמור על ידי לחיצה על אוקסיגרף. לאחר מכן OK Control ולאחר מכן שמור והתנתק. לאחר מכן, כדי לבצע הערכה נשימתית, לפתוח את החדר ולשאוף את המדיום בפנים.
טען תאי זרע בנפח סופי של שני מיליליטר MRM לניתוח תאים חדירים. טען את הכיול על ידי לחיצה כפולה על תיבת הכיול של הקופה בפינה התחתונה ופתיחת הכיול שבוצע קודם לכן. ואז להפסיק את הניסוי.
להזריק 4.5 מיקרוליטר של 10 מילימולר digitonin לחדור את התאים במשך חמש דקות. רשום את הנשימה של התאים השלמים במשך חמש דקות לפחות עד לקבלת אות יציב. לאחר מכן הוסף את המצע עבור קומפלקס I או קומפלקס II.מדוד את צריכת החמצן עד שהאות גדל ומתייצב.
לאחר מכן, הזריקו חמישה מיקרוליטרים של ADP מולארי 0.5 ומדדו את צריכת החמצן עד שהאות עולה ומתייצב. הוסף מיקרוליטר אחד של ארבעה מיליגרם למיליליטר אוליגומיצין, שהוא מעכב ATP סינתאז. מדדו את צריכת החמצן עד שהאות פוחת ומתייצב.
טיטראט על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של FCCP בשלבים עוקבים, החל מ-0.1 מילימולר ועד מילימולר אחד עד שמגיעים לקצב נשימה בלתי מצומד מקסימלי. מדוד את צריכת החמצן עד שהאות גדל ומתייצב. להפסיק להזריק את התרופה כאשר צריכת החמצן מתחילה לרדת.
לבסוף, הזריקו מיקרוליטר אחד של רוטנון מילימולרי אחד עבור קומפלקס I או אנטימיצין A של חמישה מילימולרים עבור קומפלקס II כדי להבחין בין צריכת החמצן במיטוכונדריה לבין שיורית החמצן. מדדו את צריכת החמצן עד שהאות פוחת ומתייצב. כדי לבצע ניתוח נתונים, בחר אזורים שבהם שטף החמצן לכל נפח מתואם יציב לאחר הזרקת מצע או מעכב, לחץ על סימנים, ולאחר מכן על חלונות סטטיסטיקה וייצא את הנתונים.
לנרמל את הנתונים המתקבלים לכל מיליון תאי זרע ולהפחית את צריכת החמצן הלא מיטוכונדריאלית מכל הערכים. חשב את המדדים באמצעות משוואות אלה. הקלטה מוצלחת של תאי זרע שלמים מדגימת זרע הושגה כאשר הקו הכחול הראה את ריכוז החמצן והקו האדום ייצג את זרימת החמצן לכל נפח מתואם.
ספירת תאי זרע נמוכה יותר הביאה לצריכת חמצן בסיסית נמוכה יותר. יתר על כן, עקומות צריכת חמצן במיוחד עבור קומפלקס מיטוכונדריאלי I או קומפלקס II התקבלו באמצעות פרוטוקול זה.
