כדי להתחיל, צנטריפוגה FBS לילה באולטרה צנטריפוגה ב 110, 000 G וארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את sEV אנדוגניים. עקרו את הסופרנאטנט על ידי סינונו דרך קרום אולטרה-סינון של 0.2 מיקרון כדי להפיק FBS נטול sEV. לאחר מכן בצלחת תרבית של 150 מילימטר, צלחת בערך 3 פעמים 10 עד המקרופאגים המונצחים השביעי שמקורם במח עצם ב -20 מיליליטר של מדיום תרבית DMEM.
יש לדגור על התבשיל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו-חמצני למשך הלילה, לפני איסוף ה-sEV מהמקרופאגים. למחרת, לאחר השלכת המדיום, לשטוף את התאים עם מלוחים חוצץ פוספט או PBS. יש להחליף את המדיום ב-DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי נטול sEVs לפני הדגירה על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
בהתאם לדרישות הניסוי, יש לאסוף ולהעביר את הסופרנאטנט של התאים לצינורות צנטריפוגות של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 G במשך 10 דקות כדי להסיר את התאים. מעבירים את התוצאה בסופרנאטנט מכל צינור לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר ומשליכים את הכדורית.
הפעם, צנטריפוגו את הסופרנאטנט ב-2000 גרם למשך 10 דקות כדי להסיר תאים מתים. לאחר מכן העבירו את הסופרנאטנט לצינורות צנטריפוגות מהירים חדשים והשליכו את הכדורים. ליד כדי להסיר פסולת ו microvesicles, צנטריפוגה supernatant המתקבל ב 10, 000 G במשך 30 דקות באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה.
העבר את הסופרנאטנט שנוצר לצינורות אולטרה-צנטריפוגות חדשים על ידי הוספת 35 מיליליטר בכל צינור והשלכת הכדורים. צנטריפוגה צינורות אולטרה צנטריפוגות בצנטריפוגת רוטור דלי מתנדנד ב 110, 000 G במשך 70 דקות לפני השלכת supernatant. שטפו את הגלולה הגולמית המתקבלת מועשרת ב-sEV במיליליטר אחד של PBS.
שוב, להוסיף מיליליטר אחד של PBS לגלולה שטופה באחד הצינורות, ולערבב על ידי pipetting ברציפות. מעבירים את המיליליטר האחד של תרחיף PBS שנוצר לצינור אחר המכיל את הכדור, וחוזרים על אותו הדבר עד שכל הכדורים בצינורות מעורבבים על ידי פיפטינג. העבר את המיליליטר המתקבל של PBS עשיר ב- sEV לצינור אולטרה-צנטריפוגה חדש.
ואז צנטריפוגה את הצינור החדש ב ultracentrifuge שולחן ב 110, 000 G במשך 70 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, שטפו את הגלולה הגולמית המועשרת ב-sEV עם 100 מיקרוליטר של PBS. הוסף 1.2 מיליליטר של תמיסת הכנת חלבון בצינור חלבון סטנדרטי כדי להמיס את 30 מיליגרם של BSA נוכח בו.
דללו את תמיסת החלבון הסטנדרטית המתקבלת עם PBS כדי להפחית את ריכוזה מ-25 ל-0.5 מיליגרם למיליליטר. הוסף שמונה נפחים שונים של תמיסת החלבון המדולל הסטנדרטית לבארות של צלחת בת 96 בארות, והבא את הנפח ל -20 מיקרוליטר בכל באר באמצעות PBB. הוסף 18 מיקרוליטר של חיץ HEPES lysis לבארות הדגימה, ולאחר מכן הוסף שני מיקרוליטרים של דגימות sEVs.
לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של פתרון עבודה BCA שהוכן לפי הוראות היצרן לכל באר. הניחו לצלחת לנוח בטמפרטורת החדר למשך 20 עד 30 דקות. לבסוף, מדוד את הספיגה ב 562 ננומטר באמצעות קורא microplate.
חשב את תכולת החלבון הכוללת ב- sEVs באמצעות התוצאות שהתקבלו. תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת של כלי רכב חשמליים מבודדים הציגו מורפולוגיה טיפוסית דמוית. ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים הראה כי כלי הרכב החשמליים המבודדים היו מרוכזים בעיקר ב-136 ננומטר.
כתם מערבי הראה כי כלי רכב חשמליים מבודדים הועשרו באופן משמעותי מסמני sEV, כולל CD9, בטא-אקטין ו-TSG101. הסמן האנדופלסמי GRP94 זוהה רק בליזט של התא כולו. התוצאות הצביעו על כך שהשיטה בה נעשה שימוש הניבה כלי רכב חשמליים ברמת טוהר גבוהה.
