בתור התחלה, רססו ביסודיות את העכבר הגברי C57 שחור 6J בן 10 שבועות שהוקרב ב-70% אתנול. בעזרת מלקחיים, הסירו את העור מהגפה האחורית ונתחו את כל שרירי הגפיים המקיפים את עצם הירך, השוקה והפיבולה. הכניסו את שרירי הגפיים שנקטפו לתוך צינור של שני מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של חיץ בידוד שרירים.
ובאמצעות מספריים, לטחון את השרירים שנקטפו. מעבירים את מתלה השריר הטחון לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 18 מיליליטר של חיץ בידוד שרירים. סגרו את הצינור בחוזקה, אטמו אותו בסרט מעבדה והניחו אותו אופקית באמבט מים מטלטל.
לאחר 30 דקות, להוסיף חמישה מיליגרם של סוג I collagenase ולשמור על הצינור במשך 30 דקות נוספות. לאחר הקפצת מתלה השרירים למעלה ולמטה 10 פעמים, צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט, תוך השארת חמישה מיליליטר של התווך בצינור. פיפטה את המתלה על מסננות התאים העוקבות ולאסוף את הזרימה לתוך צינור 50 מיליליטר.
צנטריפוגו את המתלה והשליכו את הסופרנאטנט עד שנותרו רק 100 עד 200 מיקרוליטר בצינור. השהה מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של חיץ ליזה של תאי דם אדומים ודגור על קרח במשך שלוש דקות. צנטריפוגה שוב ולהסיר את supernatant מן הצינור באמצעות פיפטה 20 עד 200 מיקרוליטר.
השהה מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של חיץ FACS קר והנח את הצינור על קרח. לאחר הסרת 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצורך הבקרה השלילית, צנטריפוגו את 90 המיקרוליטרים הנותרים והשליכו את הסופרנאטנט לפני הדגירה על התאים עם 400 מיקרוליטר של כתם כדאיות הניתן לתיקון המדולל ב- DMEM ללא סרום למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, הוסף 100 מיקרוליטר של חיץ FACS והפוך בעדינות את הצינור שלוש פעמים.
צנטריפוגה שוב ולהוסיף 100 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים ראשונית לתוך הצינור. לאחר 30 דקות של דגירה בחושך, צנטריפוגה ולהשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן להוסיף 500 מיקרוליטר של PBS כדי לשטוף את התאים.
צנטריפוגה שוב ולהסיר את supernatant לפני resuspending את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של חיץ FACS. מעבירים את המתלה לצינור חמישה מיליליטר. מערבל בקצרה את תרחיף התא לפני עיבודו על ציטומטר זרימה.
אסוף את התאים שנבחרו בצינור מצופה חמישה מיליליטר המכיל מאגר FACS. 75% מהתאים החד-גרעיניים שזוהו בהתבסס על גודלם וגרעיניותם היו שליליים לסמן הכדאיות הניתן לקיבוע, מה שהוביל לממוצע של 34.3% מהתאים החיים. כ -3% מהתאים החיים הבודדים היו שליליים עבור מונוציטים, אנדותל, לויקוציטים וסמנים ספציפיים אריתרואידים.
תאים שליליים אלה נבחרו לאחר מכן על פי הביטוי שלהם של סמני CD34 ו- ITGA7. גאטינג סופי עבור CXCR4 בוצע כדי לבחור תאי לוויין משוערים. ומהתאים החיוביים ל-ITGA7 חיוביים ל-CD34, 80% נמצאו חיוביים ל-CXCR4.
