כדי להתחיל, יש ליטול מיליליטר אחד של תרבית תאי שמרים בשלב הבינוני, המבטא HyPer7 הממוקד במיטוכונדריה. צנטריפוגה את התאים ב 6, 000 G במשך 30 שניות, ולהסיר את supernatant, משאיר 10 עד 20 מיקרוליטר בצינור. השהה מחדש את גלולת התא על ידי ערבוב עדין עם מדיה שיורית באמצעות מיקרו-פיפטה.
לאחר מכן, השתמש במפוח אוויר או ברקמה נטולת סיבים כדי לנקות מגלשה במיקרוסקופ זכוכית, והוסף 1.8 מיקרוליטר של תרחיף התא לשקופית. לבסוף, כסו את התאים בכיסוי זכוכית מספר 1.5 על ידי הורדתו לאט בזווית כדי למנוע החדרת בועות. לאחר מכן הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ.
כדי לצלם את התאים, הגדר את תנאי הרכישה כדי להבטיח אות ניתן לזיהוי ורזולוציה מקובלת בכל ערוץ פלואורסצנטי. לדוגמה, במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב עם מצלמת sCMOS השתמש בכריכה של 2x2, עוצמת לייזר של 20% עד 40% וחשיפה של 200 עד 600 אלפיות השנייה. לאחר מכן, בדוק את היסטוגרמה התמונה.
בתמונה של 12 סיביות, ודא שהטווח הדינמי הכולל של ערכי הפיקסלים הוא לפחות כמה מאות רמות אפור ללא רוויה. בנוסף, ודא שהטווח גבוה בסדר גודל אחד מרמת הרעש. לחישוב רמת הרעש, מדדו את סטיית התקן של ערכי פיקסלים באזור נטול תאים בתמונה.
לאחר מכן אספו תמונות בהילוך מהיר ללא עיכוב בין רכישות כדי להעריך את ההשפעות של תנאי ההדמיה על יציבות האות ועקה חמצונית במיטוכונדריה. באמצעות תוכנת רכישת המיקרוסקופ או ImageJ, מדוד את ערך הפיקסלים הממוצע בכל ערוץ פלואורסצנטי כדי להבטיח את יציבות האות. אם הניסוי אינו כולל הדמיה בהילוך מהיר, ודא שהפלואורסצנטיות יציבה על פני שתיים או שלוש ערימות Z חוזרות.
רכוש תמונות עם מרווח Z של 0.5 מיקרומטר בעומק ערימה כולל של שישה מיקרומטר עבור שמרים ניצנים. בשעת איסוף ערימות Z, ודא שמרווח הזמן Z זהה לכל התמונות בערכת הנתונים וכולל את התא כולו. כמו כן, רכשו תמונות אור משודרות כדי לתעד את גבולות התא.
