כדי להתחיל, פתח תמונת מחסנית Z רב-ערוצית בפיג'י, ופתח את קובץ הסקריפט הרצוי לניתוח biosensor. לחץ על הפעל בחלון עורך הסקריפט כדי להפעיל את קובץ ה- Script. לאחר מכן הזן את המידע המבוקש בחלון הדו-שיח שמופיע.
בחר את מספרי הערוצים של המונה והמכנה לחישוב יחס. עבור HyPer7 הממוקד במיטוכונדריה, הנומרטור הוא הערוץ המעורר ב-488 ננומטר והמכנה הוא הערוץ המעורר ב-405 ננומטר. בחרו במספר הערוצים של תמונת האור המשודרת אם קיים, או אפס אם קיים.
לאחר מכן בחר את שיטת חיסור הרקע הרצויה. אם הרקע אחיד, לחצו על בחירת אזור בתמונה למדידת רמת הרקע בתמונה. לאחר מכן, בחר את שיטת חיסור הרעש הרצויה כדי להפחית את השונות האקראית בקריאת הגלאי.
לחץ על בחר אזור תמונה. בחרו באפשרות הערך הקבוע כדי להזין רמת רעש שנמדדה קודם לכן, שבדרך כלל פועלת היטב אם תנאי ההדמיה נשמרים קבועים. לזיהוי מדויק ועקבי של מיטוכונדריה, בחרו אלגוריתם סף כגון Otsu או Maximum Entropy.
השתמשו באותו אלגוריתם עבור כל התמונות בניסוי, אך ודאו שהמיטוכונדריה מזוהים במדויק. לאחר מכן בחר את מספר אזורי העניין בכל תא. לדוגמה, אם מודדים הבדלים בין ניצני אם, בחר שניים.
בחר בתיקיית הפלט שבה יישמרו מדידות ותמונות יחס. לתיקון רקע או רעש, בחרו 'בחר אזור בתמונה'. פעל בהתאם להנחיות כדי לצייר אזור רקע באמצעות כלי החזר ההשקעה המלבני ולחץ על אישור.
בעת ניתוח תאים בודדים או אזורים תת-תאיים, צייר אזורי עניין בהתבסס על תמונת שדה בהיר. החזר ההשקעה אינו חייב להתאים במדויק לקווי המתאר של התא מכיוון שרק מיטוכונדריה סף בתוך החזר ההשקעה יימדדו. לאחר יצירת כל החזר השקעה, הקש T כדי להוסיף את החזר ההשקעה שנבחר למנהל החזר ההשקעה.
סמן את הצג הכל במנהל החזר ההשקעה כדי לתעד את התאים המסומנים. כל אזור נוסף יופיע כפריט ממוספר ברשימה של מנהל החזר ההשקעה. אם אתה מנתח יותר מהחזר השקעה אחד לכל תא, סמן את החזר ההשקעה באותו סדר עבור כל תא מנותח.
לאחר שכל ה- ROI הרצוי נוספו למנהל החזר ההשקעה, לחץ על בסדר בחלון הדו-שיח סימון תאים. לאחר מכן, בחר את תבנית טבלת המדידה. בחלון הדו-שיח 'מידה מרובה', בדקו את האפשרויות 'מדידה של כל הפרוסות' ו'שורה אחת לפרוסה' כדי להפיק טבלה בתבנית הרצויה.
השתמש בתהליך טבלאות ROI מרובות. Rscript כדי לעבד את הטבלאות שנוצרו באמצעות האפשרות שורה אחת לפרוסה. אל תסמן את האפשרות צירוף תוצאות.
שמור את קבצי הפלט בתיקייה שנבחרה באמצעות הסקריפט. כעת פתחו את תמונת מחסנית היחס Z בפיג'י ליצירת תמונת יחס צבעוני. לאחר מכן פתח את colorize_ratio_image.
קובץ סקריפט ijm ולחץ על הפעל בחלון עורך הסקריפט. יופיע חלון דו-שיח המבקש להזין את המידע המבוקש. באפשרות ללא אפנון, כל הפיקסלים במיטוכונדריה מופיעים באותה בהירות.
תמונות מסוימות עשויות להיראות רועשות, שכן פיקסלים עמומים ובהירים תורמים לתמונת היחס. השתמש באפשרות אפנון העוצמה כדי להפחית את הרעש. בשיטת הערכים המינימליים והמרביים המוצגים, בחר ערכים הקרובים לערכי המינימום והמקסימום הממוצעים שנצפו בניסוי.
כדי להבטיח עקביות, רכשו את כל התמונות באותם תנאי הדמיה והציגו את כל התמונות באותם ערכי מינימום ומקסימום. לאחר מכן בחרו במצב ההקרנה כדי להקרין את ערימת Z ולהציג את כל אוכלוסיית המיטוכונדריה לפני הצביעה. להקרנה בעוצמה מרבית, בחר מקסימום.
ליצירת הקרנה בעוצמה ממוצעת, בחר ממוצע. לבסוף, בחר את התיקיה כדי לשמור את התמונות הצבעוניות. אם האפשרות 'ללא אפנון' נבחרה, בחרו ערכת צבעים בחלון הדו-שיח שיופיע.
השתמש בטבלאות בדיקת האש או הקשת RGB המובנות בפיג'י או בכל טבלת חיפוש רצויה בפורמט LUT של ImageJ. השתמש בסקריפט כדי לשמור את קבצי הפלט בתיקייה שנבחרה. היחס המופחת המחומצן של המיטוכונדריה המתויג HyPer7 הראה תגובה תלוית מינון לריכוז מי חמצן, שהגיע לרמה של מילימולר עד שני מילימולרים שנוספו חיצונית במי חמצן.
הבדלים במי חמצן במיטוכונדריה נצפו בתוך תאי השמרים. ירידה מובהקת סטטיסטית בקריאת ביוסנסור של מי חמצן זוהתה במיטוכונדריה באיבה בהשוואה לתא האם.
