לאחר בנייה ויישור מערכת המיקרוסקופ הדו-פוטוני הרגיש לקיטוב, בהתאם לייצוג הסכמטי המוצג, יש לבדוק את איכות היישור האופטי עם דגימת ייחוס איזוטרופית כמו פלואורסצאין המגולם בפולימר אמורפי. לשם כך, הפעל את לייזר העירור ומדוד את הגרפים הקוטביים של 360 מעלות של דגימת הייחוס עבור לוח חצי גל אפס. התאימו את זווית לוח חצי הגל כך שתתאים לצירי X ו-Y של מישור הדגימה, ובדקו אם שתי הפוטודיודות צוברות עוצמות דומות של שני רכיבי פליטה מעוררי פוטון.
כדי לנתח את הדגימה, הרכיבו את מגלשת הזכוכית עם דגימת ספרוליט זו על הבמה הפיזואלקטרית, וודאו שפני השקופית המכילה את תלוש הכיסוי פונים למטרת טבילת הצמצם המספרי הגבוה. לאחר מכן אבטחו את מגלשת הזכוכית באמצעות סרט הדבקה. לאחר מכן, על ידי התאמת מיקומי X, Y ו- Z באמצעות ידיות המיקרוסקופ, מקדו את המטרה על הספרוליט בתמיסה.
התמקדו במיוחד באזור המרכזי של המבנה כולו, שכן קוטר הספרוליט הוא בדרך כלל בטווח של עשרות מיקרונים. לאחר מכן מרכזו את הספרוליט הזה בשדה הראייה במישור המיקרוסקופ. קבע את גודל סריקת XY על-ידי התאמת מספר שלבי שלב Piezo בכיווני X ו- Y כדי לכסות את כל שטח המבנה.
התאם את הפרמטרים של Piezo Stage כגון מהירות סריקה, גודל צעד וטווח כדי לכסות את שטח הספרוליט כולו. פתחו את התריס, הפעילו את הפוטודיודות ואספו את רכיבי הפליטה X ו-Y בעוצמה פלואורסצנטית מעוררת של שני פוטונים עבור כל צעד וצעד באזור הסריקה שנבחר עבור קרן העירור המקוטבת המתאימה לצירי X ולאחר מכן לצירי Y. לאחר מכן סרוק את דגימת הספרוליט הזו, והתוצאה היא פלואורסצנטיות מעוררת של שני פוטונים.
כדי לבצע ניתוח קיטוב מלא מהנקודה הספציפית בדגימה, כבה את קרן העירור. קח קואורדינטות ספציפיות של שלב Piezo המתאים למיקום שנבחר על ספרוליט זה שבו המידע על הכיוון של מולקולות נדרש עם רזולוציה submicron. כוונן את השלב הפיזואלקטרי כדי למרכז את שדה הראייה בקואורדינטות X ו- Y שצוינו.
לאחר הפעלת קרן העירור, הפעל את סיבוב 180 המעלות של לוח חצי הגל כדי לבצע ניתוח קיטוב מלא של 360 מעלות של רכיבי הפליטה X ו- Y של פליטת הפלואורסצנטיות הנרגשת של שני פוטונים. התמונה של אינסולין ספרוליט שהתקבל לאחר ביצוע סריקת רסטר 2PFM הייתה עקבית עם אלה שדווחו עבור ספרוליט. המיקום של צלחת חצי הגל המתאים לעירור הדגימה לאורך צירי X ו- Y אומת גם הוא.
הגרפים הקוטביים השתנו בעת ביצוע ניתוח קיטוב מלא מנקודות נבחרות שונות. מחוץ לספרוליט, גרף אש"ף נראה כמו אוסף של ממצאים וקוצים אקראיים של רעשי אות. פוליגרפים שנמדדו כראוי ממקומות מסודרים מאוד לאורך צירי X ו- Y היו בעלי צורות וגיאומטריות שונות בהתאם לכיוון המקומי ולארגון של פלואורופורים.
