Liberase-Based Enzymatic Purification of Microglial Cells Isolated from a Mouse Spinal Cord

כדי להתחיל, עם אזמל, לעשות חתך לאורך קו האמצע הגבי של עכבר המתת חסד מן העורפית לאזור העצה. באמצעות מיקרוסקופ כירורגי סטריאוסקופי, יש לנתח בזהירות דרך שכבות עד לעמוד השדרה המותני. זהה את הקשת הקוסטלית האחרונה.

זהה את החוליה הצווארית האחרונה ואת העצה. לאחר מכן בצע חתך כדי להפריד את עמוד השדרה. עם זוג מלקחיים מנתחים, לבצע למינקטומיה גבית של החוליה כדי לחלץ את חוט השדרה.

הסר את העצבים היוצאים דרך הפורמינה המהווים את מערכת העצבים ההיקפית. כעת, הניחו את חוט השדרה שחולץ על לוח ניתוח. עם זוג מספריים vannas, לחתוך אותו לחתיכות בגודל שני מילימטר.

לאחר מכן מעבירים את החתיכות למיקרו-צינור בעל תחתית שטוחה של שני מיליליטר. הוסף מיליליטר אחד של פתרון עבודה HBSS-LD למיקרו-צינור. דוגרים על התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.

הקפידו לערבל במרץ את התערובת כל חמש דקות. לאחר מכן, להעביר את התוכן של כל עיכול דרך מסננת בגודל 40 מיקרון. לאחר מכן להוסיף שבעה מיליליטר של HBSS עם 2% FBS כדי לנטרל את העיכול ולמחוץ את הרקמה הנותרת.

מעבירים את המתלה לצינור חרוטי של 50 מיליליטר לפני צנטריפוגה ב 220 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. כעת השתמשו במיקרופיפטה של מיליליטר כדי להשליך את הסופרנטנט. לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של HBSS-FBS בצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר.

הוסיפו לצינור שני מיליליטרים של מדיום שיפוע צפיפות איזוטונית של 90%, וצנטריפוגו את התערובת ב-160 גרם למשך 25 דקות ב-18 מעלות צלזיוס. לבסוף, עם פיפטה העברה, לאחזר את interphase ולהעביר אותו צינור חרוטי 15 מיליליטר. לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב 220 גרם במשך חמש דקות בחמש מעלות צלזיוס לפני ניסויים נוספים.

טיהור תאי המיקרוגליאה שחולצו הניב תפוקת תאים של עד 99% כפי שאושר על ידי צביעת FACS. נצפו תאים חיוביים כפולים בגודל ממוצע של 10 מיקרומטר התואמים למיקרוגליה לא פעילה.