Immunostaining of Agarose-Embedded Lung Tissue Sections

התחילו בהטבעה של רקמת ריאה ואגרוז וחתך אותה באמצעות ויברטום. לרקמות פרוסות, להוסיף 300 מיקרוליטר של סוכן חוסם. דוגרים על הצלחת בארבע מעלות צלזיוס על שייקר עם תסיסה עדינה במשך 45 דקות.

לאחר מכן, פיפטה 300 מיקרוליטר של PBS דילל נוגדן ראשוני לתוך כל באר. דוגרים על הצלחת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס עם רעד עדין. כעת יש להוציא בעדינות את הנוגדנים הראשוניים מבלי לגעת בפרוסה.

לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם 400 מיקרוליטר של PBS. לאחר מכן, פיפטה 300 מיקרוליטר של נוגדנים משניים לדלל לתוך כל באר. הסר את תמיסת הנוגדנים לאחר דגירה קרה במשך 90 דקות.

לאחר מכן מוסיפים את DAPI ואת לקטין עגבניות 488 לבארות. דוגרים על התערובת במשך 30 דקות. לאחר הסרת DAPI ולקטין עגבניות, לשטוף את הפרוסות PBS במשך שלושה מחזורים של 10 דקות.

בעזרת מברשת, העבירו את הפרוסות לשקופית. הניחו שלוש טיפות של אמצעי הרכבה על המגלשה והרכיבו מכסה מחליק מעליה לפני ההדמיה. קטעי הריאה של דגימות עכבר, חזיר ובני אדם הוכתמו באופן אימונופלואורסצנטי עבור SMA, אלסטין ו-LEA.

SMA ואלסטין נצפו מפוזרים על פני מבנים כגון צינורות מכתשית, כלי דם, סימפונות ונאדיות. השוואה של התפלגות פנאומוציטים מסוג II בבני אדם בוגרים ותינוקות בוצעה. נוגדן תאי מכתשית מסוג II HT2-280 היה בעל זיקה חזקה לפני השטח של תא הפנאומוציטים.

דגימת התינוקות הניבה ספירת פנאומוציטים מסוג II גבוהה משמעותית. עם זאת, מדגם התינוק הציג גם כיסוי פיגומים גבוה משמעותית מאשר המבוגר. גם מספר הפנאומוציטים מסוג II המבוססים על כיסוי פיגומים היה גבוה משמעותית בתינוקות.