Purification of Human Solute Carriers (SLCs) for Developing SLC Targeting Therapies

התחילו בהפשרת נשאי המומסים הקפואים או כדורי תאי SLC באמבט מים בטמפרטורת החדר. הכינו חיץ מסיסות על ידי שילוב של 135 מיליליטר של חיץ בסיס ושלוש טבליות קוקטייל מעכבות פרוטאז. לאחר המסת הטבליות, השהה מחדש את הגלולה במאגר המסיסות.

לאחר מכן מוסיפים deaminase ומעבירים את המתלה לתוך הומוגנייזר מקורר קרח. הומוגניזציה של התמיסה על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה בערך 20 פעמים, שמירה על הומוגנייזר על קרח. לאחר מכן, הוסף תמיסת מלאי חומרי ניקוי לריכוז סופי של 1%.

מעבירים את תערובת המסיסות לצינור חרוטי של 50 מיליליטר ומסובבים לאט בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שעה, צנטריפוגו את התערובת, ואספו את הסופרנטנט. אזנו נפח מיטה של ארבעה עד שישה מיליליטר של שרף Strep-Tactin עם חיץ הבסיס.

לאחר מכן מוסיפים שרף מאוזן לסופרנאטנט המסיס, ומסובבים במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס. יוצקים את התמיסה על עמוד זרימת כבידה ומאפשרים לתמיסה לזרום דרכה. שטפו את השרף בנפח מיטה גדול פי 30 מזה של Strep Wash Buffer בשלושה שלבים שווים.

לאחר מכן, להוסיף שלושה עד חמישה מיליליטר של חיץ אשליה לדגור במשך 15 דקות לפני איסוף elute. מדידת ריכוז החלבון על ידי ספקטרוסקופיית ספיגת UV. שלב את שברי האשליה הרצויים, והוסף פרוטאז 3C.

סובבו את הצינור באיטיות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, יש לאזן שניים עד ארבעה מיליליטר מנפח המיטה של שרף זיקה מתכתי קובלט עם חיץ SEC. הוסיפו את שרף הזיקה של מתכת קובלט לתערובת התגובה 3C למשך הלילה, וסובבו בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר שעה, יוצקים את התמיסה לתוך עמוד זרימת כבידה ואוספים את הזרימה דרכה. רכז את הזרימה במסנן צנטריפוגלי בחיתוך של 100 קילודלטון על ידי סיבוב ב 3000 גרם בארבע מעלות צלזיוס. עמודת SEC מבוססת דקסטרן ארגוס מאוזנת עם מאגר SEC.

הזריקו את הדגימה ללולאת הדגימה והפעילו את תוכנית ה-SEC עם קצב זרימה, כך שלחץ העמודה יהיה נמוך מהמפרט של יצרן העמודה. באמצעות אספן שברים, אספו 300 שברים מיקרוליטר לאורך כל ריצת ה-SEC. לאחר איגום שברי שיא, מדדו את הספיגה ב-280 ננומטר.

לאחר מכן רכז את הדגימות לנפח הנדרש במסנן חיתוך של 100 קילודלטון. ביטוי ראשוני של חלבון SLC בקנה מידה קטן נותח על ידי אלקטרופורזה של דף SDS. מיקרוסקופ פלואורסצנטי של A GFP מתויג SLC, אישר את לוקליזציה חלבון, ספציפי לקרום פלזמה עם הצטברות תאית משמעותית.

חלבון הומוגני מבחינה כימית ומבנית הניב שיא מונו פיזור A280 יחיד במהלך כרומטוגרפיית אי הכללת גודל.