כדי להתחיל, תייג שני שפופרות פקס חדשות כשפופרות מעורבות אחת ושתיים. הכן את תרחיף התא והנוגדנים לפי הטבלה הנתונה לניתוח ציטומטרי זרימה. לאחר הדגירה על הצינורות במשך 30 דקות, שטפו כל צינור פעמיים עם מיליליטר אחד של חיץ מכתים.
צנטריפוגות את הצינורות המערבלים ב 200 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של חיץ מכתים. מצפים את הבארות של צלחת באר 48 עם 200 עד 500 מיקרוליטר של FBS, ולשמור במשך שעה אחת.
ואז פיפטה 200 עד 500 מיקרוליטר של 10% MSC מדיה לאחר הסרת FBS שיורית. כדי להכין את הדגימות למיון תא יחיד, פיפטה מיליליטר אחד של FBS לשני צינורות פקס חדשים. גלגלו את הצינורות ליצירת שכבה אחידה של ה-FBS על פני השטח הפנימיים של הצינור.
הכינו את תרחיף התא והנוגדנים בצינורות מעורבים אחד ושניים, לפי הטבלה, לניסוי המיון. לאחר מכן לדגור את הצינורות בחושך במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה עם חיץ מכתים, צנטריפוגו את הצינורות ב 200 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן יש להשהות מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ מכתים ולדגור במשך 15 דקות בחמישה מיקרוליטרים של DAPI לפני המיון. כדי להגדיר את מטריצת הפיצוי, השתמש בצינורות פיצוי הכתם היחיד. לחץ על ניסוי מסרגל הכלים בתוכנת המכשיר.
לאחר מכן לחץ על הגדרת פיצוי, ולאחר מכן צור בקרות פיצוי. לאחר מכן, לחץ על צינור לא מוכתם, ואחריו פרמטרים בתיבת הדו-שיח ציטומטר. התאם את המתחים על ידי עריכת הערכים עבור כל פרמטר.
לחץ על טען בלוח המחוונים של הרכישה ולאחר מכן לחץ על רכישה. גרור את שער P-1 לאוכלוסיית התא והחל אותו על כל בקרות הפיצוי כדי להגדיר את שער המתח והשער השלילי עבור כל פרמטר. כעת טען את צינורות פיצוי הכתם היחיד בנפרד.
הקלט את הנתונים ושמור אותם. בחר את הניסוי הנוכחי, לחץ עליו באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר חשב ערכי פיצוי, ולאחר מכן קשר ושמור. הפעל את הצינור המעורב אחד והקלט 10, 000 תאים.
הגדר את השערים על האוכלוסייה המעניינת כדי להיות ממוין עם אסטרטגיית gating נכונה. לאחר מכן, לטעון צלחת איסוף לתוך המכשיר ולהגדיר מספר תא היעד, הנע בין 2, 500 ל 5, 000 תאים לכל באר. לאחר מכן בחרו במסיכת הטוהר למיון תא בודד.
אספו את אוכלוסיות התאים הממוינות במכשיר איסוף, ושמרו אותן על קרח למשך ניסוי המיון. לבסוף, העבירו את הלוחות לאינקובטור של 5% פחמן דו חמצני כדי לשמור על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. תרשימי מבחני ציטומטריית הזרימה הרב-פרמטרית לא הראו ביטוי של איזוטיפ FITC של נוגדני CD 90 FITC.
ניתן להשוות את הביטוי החיובי של הסמנים CD-90 ו-CD-73 ואת הביטוי השלילי של CD-45 לזה של פקדי ה-FMO והלא מוכתמים שלהם. הפנוטיפים האימונוגרפיים הראו את התפלגות הסמנים מאחד הקטעים המוקדמים עם הסמנים המומלצים של ISCT ו- CD-44, וקבעו את אוכלוסיות האב כ- MSC. סככות המעבר המאוחרות שימשו למיון תא בודד של אקספרסורים גבוהים ועמומים.
התאים הממוינים שנאספו בצלחת 48 הקידוחים הראו היצמדות והתפשטות, כמו אוכלוסיית האם שלהם. הפוסט מיין תאים ממוינים בנוכחות גורמי גדילה אדיפוגניים.
