Preparation of FFPE DNA and RNA Samples for Sequencing Using an Automated Purification Instrument (API)

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

88 Views

•

02:34 min

•

September 8th, 2023

DOI :

10.3791/200724-v

September 8th, 2023

•

Christophe Bontoux¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Virginie Lespinet-Fabre¹^,²^,³^,⁴, Olivier Bordone¹^,²^,³^,⁴, Virginie Tanga¹^,²^,³^,⁴, Maryline Allegra¹^,²^,³^,⁴, Myriam Salah¹^,²^,³^,⁴, Salomé Lalvée¹^,²^,³^,⁴, Samantha Goffinet¹^,²^,³^,⁴, Jonathan Benzaquen³^,⁴^,⁵^,⁶, Charles-Hugo Marquette³^,⁴^,⁵^,⁶, Marius Ilié¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Véronique Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵, Paul Hofman¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, ²Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ³Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, ⁴FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, ⁵Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, ⁶Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

Transcript

כדי להתחיל, לחתוך את פורמלין קבוע פרפין משובץ או FFPE DNA ודגימות RNA. הפעל את מכשיר הניקוי האוטומטי או מכשיר ה- API והיכנס באמצעות שם המשתמש והסיסמה. לאחר מכן, בתוכנת Integrated Genomic Viewer, תחת דוגמאות, לחץ על צור דוגמאות"הזן את שם המדגם ובחר את קטגוריית היישום.

לאחר הזנת פרטי המדגם, לחץ על שמור"לאחר מכן בחר ריצות"לחץ על דוגמה לתוצאה"והזן את שם הריצה לפני לחיצה על הבא"בחר את הבדיקה ואחריה מדגם של עניין ולחץ על הבא"לאחר בחירת כל מדגם, לחץ על הקצה"ולאחר מכן בדוק את פרמטרי elution ושמור את הריצה. מניחים דגימות רקמת FFPE ושפופרות עיבוד דגימה. צנטריפוגה את הצינור ב 2, 000 G במשך דקה אחת.

הוסיפו לצינורית את תערובת האב Protease Digest שהוכנה מערכת טיהור חומצות גרעין. דגרו על הדגימה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן דגרו עליה בטמפרטורה של 90 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר קירור הדגימות, הרימו את הצינור הפנימי של צינור עיבוד הדגימה ונעלו אותו על ידי פנייה שמאלה.

צנטריפוגה הצינור הפנימי ב 2, 000 G במשך 10 דקות. לאחר מכן פתח את נעילת הצינור על ידי פנייה ימינה והפרדתו מהצינור השני. השליכו את הצינור הפנימי והניחו את הצינור החיצוני על קרח עד להעמסה על ה-API.

הכינו תערובת אב לעיכול DNA והעמיסו בצלחת טיהור FFPE DNA ו-RNA ממולאת מראש. טען את הדגימות המוכנות בצלחת טיהור FFPE DNA ו- RNA אחת. במסך ה- API, לחץ על הפעלה", בחר את תוכנית ההפעלה ולחץ על הבא"עקוב אחר ההוראות שעל המסך כדי לטעון את החומרים המתכלים והריאגנטים הדרושים לריצת הטיהור.

לאחר טעינת כל הריאגנטים, לחץ על הבא"סגור את דלת ה- API ולחץ על התחל"T בסוף הריצה, לחץ על בטל" ומיד הסר את צלחת ארכיון חומצות הגרעין 48 בארות המכילה את ה- DNA וה- RNA המטוהרים. לאחר סיום טיהור הדגימה, אטמו את הצלחת ואחסנו אותה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס.

Explore More Videos

JoVE

From the series

הערכת שינוי גנומי בחולי סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים שאינם קשקשיים