בצע בידוד של תאי נישה לימבליים, או LNCs, תוך כדי עבודה בתנאים סטריליים על שולחן עבודה נקי במיוחד. שלפו את רקמת הלימבוס ממדיום אחסון הקרנית מונח הביניים. בעזרת להב עגול כירורגי סטרילי, מגרדים ומסירים את הקשתית והאנדותל סביב הקרנית.
לאחר מכן, עם הלהב העגול הכירורגי הסטרילי, חתכו את רקמת הלימבוס ל -12 חלקים שווים, והותירו רק מילימטר אחד של רקמה משני צידי הקרנית והסקלרה. לאחר מכן, להעביר את 12 חתיכות רקמת לימבוס צלחת תרבית 35 מ"מ, ולהוסיף 1 מיליליטר של collagenase A לטבול לחלוטין את הרקמות בצלחת. לעכל את הרקמות על ידי דגירה צלחת התרבית באינקובטור תאים 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות.
הפשירו את מטריצת המטריגל או ממברנת המרתף במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הכינו שקית מעוקרת המכילה 200 מיקרוליטר ו-1 מיליליטר קצוות, צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וצלחת 6 בארות, והניחו את השקית על מינוס 20 או מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר שליפת הקצות, צינור הצנטריפוגה ו-6 פלטות באר מהצ'ילר, המשיכו לבצע את השלבים הבאים על שולחן עבודה נקי במיוחד.
בעזרת קצה 200 מיקרוליטר מקורר מראש, פיפטה 50 מיקרוליטר של מטריצת קרום המרתף המופשרת לתוך 1 מיליליטר של MESCM, ומערבבים אותו בעדינות. בעזרת קצה 1 מיליליטר מקורר מראש המותאם לפיפטה, מעבירים את מטריצת קרום המרתף המתקבלת 5% לבאר אחת של צלחת תרבית 6 בארות מקוררת מראש. נערו בעדינות את צלחת 6 הבארות אופקית לפני הכנסתה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה להכנת צלחת התרבית המצופה 5%.
לאחר עיכול של 18 שעות, שלפו את רקמת הלימבל המעוכלת collagenase A, המכילה בעיקר אשכולות קטנים גלויים. בעבודה תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי לנתק את הצבירים מרקמות סקלרליות לא מעוכלות. השקיעו את הצבירים המנותקים ב-0.25% טריפסין-EDTA בצלחת תרבית של 35 מילימטר, ודגרו על הצלחת במשך 15 דקות.
לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של MESCM עם 10% סרום נוקאאוט לצלחת כדי להרוות את עיכול התא. פיפטה עדינה את המתלה למעלה ולמטה עם קצה פיפטה 1 מיליליטר כדי לשבור את הצבירים לתאים בודדים. מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, וצנטריפוגות אותו ב-200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
מבלי להפריע לגלולת התא, הסר בזהירות את הסופרנטנט, והוסף 1 מיליליטר של MESCM כדי להשעות מחדש את התאים. בעזרת קצה פיפטה של 1 מיליליטר, פיפטה את התוכן למעלה ולמטה פעמיים עד שלוש כדי להבטיח שהגלולה כולה תלויה מחדש ב- MESCM. לאסוף 20 מיקרוליטר מן ההשעיה לספירת תאים.
לאחר מכן, באמצעות פיפטה 1 מיליליטר, להעביר את תרחיף התא למטריצת קרום מרתף 5% מצופה 6 צלחת היטב. הוסף MESCM כדי להפוך את הנפח הכולל בבאר 2.5 מיליליטר. נערו בעדינות את צלחת 6 הבארות אופקית כדי להבטיח פיזור אחיד של התאים.
לאחר הדמיה של התאים, מעבירים אותם לאינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הפרוטוקול שהודגם עיכל בהצלחה את רקמת השפה הסקלרלית של הקרנית, ויצר אשכולות שניתן היה לדמיין תחת המיקרוסקופ. כצפוי, הצבירים דמו לצורת זחל.
ה-LNCs העיקריים גדלו לאט ודרשו כ-12 ימים לתרבות. LNCs ממעבר 1 למעבר 8 נזקקו לכשלושה ימים כדי לעבור, אך קצב הגידול של LNCs לאחר מעבר 9 ירד באופן משמעותי. מבחינה מורפולוגית, LNCs היו בצורת ציר ועגולים במעבר 0.
לאחר מעבר 3, הם היו בצורת ציר עם גדלים אחידים. מספר הכפלות התאים או NCD ייצג את קצב הצמיחה של LNCs. עקומות NCD ו- NCD מצטברות גילו כי ה- LNCs גדלו הכי מהר ממעבר 3 למעבר 5.
