כדי לזהות את תאי הנישה הלימבליים או LNCs על ידי צביעה immunofluorescence, להוסיף 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל באר LNCs בתרבית 5% matrigel מצופה 6 באר. לעכל את התאים על ידי דגירה על הצלחת במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס. להרוות את העיכול על ידי הוספת 1 מיליליטר של סרום נוקאאוט המכיל MESCM לתרחיף התא.
מעבירים את מתלה התא לצינור צנטריפוגה וצנטריפוגות אותו 200G למשך חמש דקות לפני ששואפים בזהירות את הסופרנטנט. להשעות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של MESCM. לאחר מכן, באמצעות ציטופוגה, להפקיד 80 מיקרוליטר של תרחיף התא באופן שווה על ארבע שקופיות מיקרוסקופ על פי הוראת היצרן.
תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך כ 10 דקות. לאחר מכן חדרו לתאים בשקופיות באמצעות 0.2% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות. חסמו את התאים עם אלבומין בסרום בקר 2% למשך שעה אחת לפני הדגירה עם נוגדנים ראשוניים על שייקר למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, להסיר נוגדנים לא קשורים על ידי שטיפת שקופיות עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. לאחר מכן, דגרו על הדגימה עם נוגדנים משניים מתאימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה לפני שטיפת נוגדנים לא קשורים כפי שהודגם קודם לכן. כתם נגדי את הגרעינים עם DAPI בעל ריכוז של 5 מיקרוגרם למיליליטר.
לאחר איטום השקפים יש לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. באמצעות ערכת בידוד RNA לחלץ את סך RNA מ LNCs בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן באמצעות ערכת שעתוק DNA או CDNA משלימה בעלת קיבולת גבוהה, תעתיק לאחור 1 עד 2 מיקרוגרם של ה- RNA.
הכינו תמיסה של 20 מיקרוליטר המכילה 2.5 מיקרוליטר של CDNA, 0.8 מיקרוליטר של פריימר גנטי תואם, 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר PCR אוניברסלית, ו-6.7 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפולים. לאחר מכן בצע תגובת שרשרת פולימראז כמותית תוך שימוש בתנאים המתאימים. לבסוף, השתמש בטכניקת CT השוואתית כדי לבחון את ביטוי הגן היחסי.
צביעה חיסונית כפולה של המעבר הרביעי LNCs גילתה בבירור כי תאים אלה היו באופן עקבי panCK שלילי, VIM חיובי, CD90 חיובי, CD105 חיובי, SCF חיובי, PDGFR חיובי.
