כדי להתחיל, hiPSCs תרבית במדיום תחזוקה IPSC על צלחת תרבית רקמה שש בארות מצופה גורם גדילה מופחת ג'ל מטריצה חוץ-תאית. כאשר התאים מגיעים ל-80% עד 90%v, הסר את התווך מהצלחת ושטוף את התאים פעם אחת עם DPBS. לאחר מכן להוסיף 700 עד 800 מיקרוליטר של 0.48 מילימולר EDTA ולדגור במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
מוציאים את פתרון העיכול ודגרים על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש דקות. כאשר התאים מתעכלים ליריעות, יש להוסיף שני מיליליטר של מצע תחזוקת IPSCs כדי לסיים את העיכול. מעבירים את מתלה התא ללוחית חיבור נמוכה בעלת שש בארות.
דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני ו-60 סל"ד ליצירת גופי עובר כדוריים או EBs. לאחר 24 שעות, באמצעות פיפטה מהעבר, מעבירים את ה-EBs לצינור הצנטריפוגה ומאפשרים לו לשקוע במשך חמש עד 10 דקות לפני הסרת הסופרנטנט. הוסף מדיום התמיינות MSC לצינור והעבר את ה- EBs ללהב חיבור נמוך של שש בארות עם שני מיליליטר של מדיום התמיינות MSC.
תרכבו את ה-EBs על השייקר ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני במשך שבעה ימים. ביום השמיני, העבירו את ה-EBs לצינור הצנטריפוגה כפי שהודגם קודם לכן. ברגע שה-EBs משקעים, הסר את הסופרנאטנט מהשפופר.
הוסף מדיום תחזוקה MSC לתוך הצינור ולהעביר את EBs לגורם גדילה מופחת ג'ל מטריצה חוץ-תאית מצופה שש בארות צלחת עם שני מיליליטר של מדיום תחזוקה MSC. לאחר היצמדות התא, שנו את התווך עד שהתרבית תגיע למפגש של 90%. לאחר מכן, לטפל בתרבית נגזר EB עם פתרון דיסוציאציה ב 37 מעלות צלזיוס.
כאשר חלק מהתאים מתעכל לתאים בודדים, הוסף שני מיליליטר של מדיום התחזוקה של MSC כדי לסיים את העיכול ולהעביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה. שטפו את התאים הלא מעוכלים הנותרים מהבארות פעם אחת עם DPBS. ולעכל שוב כפי שהודגם בעבר.
לאחר מכן צנטריפוגו את מתלה התא ב 250 גרם למשך חמש דקות. מוציאים את הסופרנאטנט וזורעים את התאים בצלחת תרבית מצופה ג'לטין. תרבית התאים במדיום תחזוקת MSC עד 90% מפגש עם שינוי בינוני רגיל.
תרבות hiIPCs קווים כפי שהודגם בעבר. כאשר התאים מגיעים למפגש של 50% עד 60%, הסר את אמצעי התחזוקה IPSC מהצלחת. הוסף שני מיליליטר של אמצעי תחזוקה MSC.
ותרבית במשך 14 יום בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עם שינוי יומי בינוני. להבשלה של MSCs, לטפל בתרבית monolayer עם פתרון דיסוציאציה ב 37 מעלות צלזיוס. כאשר חלק מהתאים מתעכלים לתאים בודדים, הוסף שני מיליליטר של אמצעי התחזוקה של MSC לבארות כדי לסיים את העיכול ולהעביר את תרחיף התא לצינור צנטריפוגה.
שטפו את התאים הלא מעוכלים הנותרים פעם אחת עם DPBS ועיכלו אותם כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן צנטריפוגו את תרחיף התא כפי שהודגם קודם לכן וזרעו את התאים על צלחת תרבית מצופה ג'לטין. תרבית התאים במדיום תחזוקת MSC עד 90% מפגש עם שינוי בינוני רגיל.
בשיטת היווצרות EB, מושבות hiIPCs הציגו מורפולוגיה קומפקטית לפני ההתמיינות. לאחר הדיסוציאציה, נוצרו EBs כדוריים אחידים, אשר משכו נפח לאורך זמן. לאחר מכן, EBs הפכו לתאים חד-שכבתיים דבקים שהשיגו מפגש של 90% ביום ה-18 ורכשו מורפולוגיה של צורת ציר לאחר שני מעברים.
באופן דומה, בשיטה החד-שכבתית, תאים התרבו ויצרו תאים דבקים רב-שכבתיים. לאחר אריזה מספר פעמים, התאים הבשילו לתוך MSC עם צורת ציר טיפוסית ומושבה מסתחררת. ניתוח ציטומטריית זרימה גילה כי hiIPCs היו חיוביים עבור CD90 ושליליים עבור CD34, CD45, CD105 ו- CD73.
לאחר בידול, hiIPCs המניעים MSCs ביטאו CD90, CD73 ו- CD105, בעוד שנותרו שליליים עבור CD34 ו- CD45. MSCs חד-שכבתיים הראו היווצרות גבוהה יותר של משקעי סידן מאשר בשיטת EB. עם זאת, לא נצפו הבדלים משמעותיים ביכולות התמיינות אדיפוגניות וכונדרוגניות.
יכולות ההתפשטות של שתי השיטות נשמרו עד 20 מעברים.
