כדי להתחיל, קחו את דגימת השלפוחית החוץ תאית המיובשת המתקבלת מהשתן האנושי באמצעות גישת מלכודת EV. הכן מאגר ליזיס טרי עם הרכיבים המוצגים. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס כדי להמיס את דגימת הרכב החשמלי המיובש.
מחממים את הדגימה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות תוך כדי רעד ב 1, 100 סל"ד. לאחר קירור הדגימה לטמפרטורת החדר, לדלל אותה פי חמישה על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של TEAB 50 מילימולרי. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת BCA בהתאם להוראות היצרן.
הוסף טריפסין וליזין C תערובת לדגימה דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה עם רעד ב 1, 100 סל"ד. לאחר מכן להוסיף 50 מיקרוליטר של 10% חומצה trifluoroacetic או TFA כדי להחמיץ את המדגם. יתר על כן, להוסיף 600 מיקרוליטר של אתיל אצטט לדגימות מערבלים את התערובת במשך שתי דקות.
צנטריפוגה את הדגימה במשך שלוש דקות ב 20, 000 G בזהירות להסיר את השכבה העליונה מבלי להפריע לממשק. יבש את הפאזה המימית באמצעות רכז צנטריפוגות ואקום. כעת יש להשהות מחדש את הדגימה המיובשת ב-200 מיקרוליטר של 0.1% TFA כדי להחמיץ.
כדי להתפיל את הדגימה, השתמשו בחוד התפלה CA18 ומרככים אותו ב-200 מיקרוליטר של 0.1% TFA ו-80% אצטוניטריל, ולאחר מכן שתי שטיפות עם 200 מיקרוליטר של 0.1% TFA. טען את דגימת הפפטיד החומצי לתוך הקצה ושטוף אותו שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר של 0.1% TFA. Elute את הפפטידים עם 200 מיקרוליטר של 0.1% TFA ו 80% acetonitrile.
לאחר ציור ה- eluent כפי שהודגם, השהה מחדש את הדגימה המיובשת לפוספופרוטאומיקה ב- 200 מיקרוליטר של חיץ העמסה להעשרת פוספופפטידים. מוסיפים 50 מיקרוליטר של חרוזים לדגימה ומנערים במרץ במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. טען את הדגימה עם החרוזים לתוך קצה fritted וצנטריפוגה במשך דקה אחת ב 100 G.לשטוף את הקצה ברציפות עם 200 מיקרוליטר של חיץ העמסה, כביסה חוצצים אחד ושניים.
מניחים את הקצה עם חרוזים לתוך צינור חדש כדי לאסוף את phosphopeptides חמק. מוסיפים 50 מיקרוליטר של חיץ אלוציה לקצה וצנטריפוגה למשך שתי דקות ב 20 G.ואז לייבש את phosphopeptides חמק באמצעות רכז צנטריפוגה ואקום.
