שיטה חד-שלבית ודו-שלבית לבידוד נויטרופילים של חולדות לקצירת מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NETs)

כדי להתחיל את קציר מח העצם, השרו חולדה שעברה המתת חסד באתנול 75% כדי לעקר את הפרווה והעור. השכיבו את החולדה על גבה וקטעו את הגפיים התחתונות בירך כדי להגן על ראש עצם הירך. השתמש מספריים דיסקציה לחתוך דרך הרצועה במפרק hock.

לאחר מכן קפלו את מפרק הברך לאחור כדי לחשוף את עצם הירך והשוקה. בעזרת זוג מלקחיים ומספריים, הסירו בזהירות את כל השרירים, הגידים ורקמות אחרות המחוברות לעצמות. תקעו את המח דרך שני קצוות העצם בעזרת מזרק מחט 5 מ"מ כדי לשחרר את מטריצת המח.

עכשיו להשתמש מזרק טרי כדי לשטוף את מח העצם עם 10-15 מיליליטר של מדיה RPMI. צנטריפוגה את תאי מח העצם ב 300G במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-5-10 מיליליטר של מאגר ליזה של תאי דם אדומים.

לאחר הדגירה על המתלים, מוסיפים פי ארבעה נפח HBSS לתערובת. לאחר מכן צנטריפוגו את התאים ב-600G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. השתמש בגלולה המתקבלת לשימוש נוסף.

בודדו תחילה את הנויטרופילים בעזרת ערכת בידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה. שכבה 2 מיליליטר של 80-55% לכל מגיב col בצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר, ליצירת שיפוע צפיפות. לאחר מכן הכניסו את הנויטרופילים המבודדים, או את תמיסת ההשעיה של תאים שבודדו באמצעות ערכת בידוד נויטרופילים ממח עצם של חולדה, לתוך הצינור.

צנטריפוגה את הצינור ב 800G למשך 40 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. בעזרת פיפטה סטרילית, אספו את שכבת השיפוע של 70%, כולל שכבות התא בגבול 65-70%. העבר את מתלה התא לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר.

הוסיפו 15 מיליליטר HBSS לצינור והפכו בעדינות כדי לערבב את תכולתו. לבסוף, צנטריפוגה את הצינור ב 300G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלול את התאים. עבור התהליך החד-שלבי, לאחר החדרת מתלה מח העצם ישירות לתוך צינור שיפוע הצפיפות, צנטריפוגה כפי שהודגם קודם לכן.

לאחר מכן, גופפו החוצה את שכבת 70% מעבר הצבע, כולל השכבות בגבול מעבר הצבע של 75-70%. העבר את מתלה התא הזה לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר HBSS. לאחר מכן צנטריפוגו את הצינור ב-400G למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לגרוף את התאים.

ספרו את הנויטרופילים המבודדים באמצעות המוציטומטר, והעריכו את כדאיות התא באמצעות צביעה כחולה טריפאן. לשיטת שני השלבים הייתה רמת טוהר משופרת של 90% ביחס ל-50% שהושגו בשיטת הצעד האחד.