כימות פלואורומטרי וניתוח ציטומטרי של מלכודות חוץ-תאיות של חולדות נויטרופילים (NETs)

כדי להתחיל, פיפטה 50 מיקרוליטר של דגימות רשת חולדה מבודדת לצינור עם 450 מיקרוליטר של חיץ Tris-EDTA. עכשיו פיפטה 100 מיקרוליטר של תקני DNA ואת הדגימות לתוך צלחת 96 באר. הוסף נפח שווה של מגיב assay לתוך הבארות.

לאחר מכן לדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר במשך שתיים עד חמש דקות, הימנעות מחשיפה לאור ישיר. מניחים את הצלחת בקורא מיקרו-צלחות פלואורסצנטי. קבעו ספקטרום פליטה של כ-530 ננומטר וספקטרום ספיגה של כ-480 ננומטר.

לדגור על התאים במיקרוליטר אחד של כתם גרעין למשך 30 דקות. לאחר מכן, לדגור על התאים במיקרוליטר אחד של זן DNA ללא תאים במשך 10 דקות. מערבבים בעדינות את הצבעים הפלואורסצנטיים.

טען את צלחת הדגימה לתוך הציטומטר. עבור לערוץ SYTOX Green ולאחר מכן בחר את ערוץ HEXT. הגדר את התאורה לכחול 377/447, והתאם את זמן החשיפה ל- 300, 000 מיקרו-שניות.

לחץ על הגדרה ממוקדת ולאחר מכן לחץ על רשום אוטומטי כדי להתאים את המיקוד באופן אוטומטי. בחר את הערוץ הירוק SYTOX והגדר את התאורה לירוק 483/536. הגדר את זמן החשיפה עבור SYTOX Green ל- 30, 000 מיקרו-שניות.

לחץ על התחל סריקה כדי להתחיל בתהליך הסריקה. תגובות דומות בהפרשת NET הובחנו בין נויטרופילים היקפיים ומח עצם ללא קשר לגירוי PMA. רשתות עכברוש הציגו גם יכולות הצלבה מוגבלות זו עם זו.

הדגירה עם PMA הובילה לעלייה של 10% בתכולת הדנ"א ללא תאים לאחר ארבע שעות, מה שמצביע על נטייה גבוהה יותר להפעלת היווצרות רשת.