Cell-Free DNA Extraction and Analysis from Eye Humor

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

127 Views

•

02:00 min

•

January 12th, 2024

DOI :

10.3791/200817-v

January 12th, 2024

•

Noah A. Brown¹, Rajesh C. Rao¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸, Bryan L. Betz¹

¹Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Kellogg Eye Center, University of Michigan, Ann Arbor, ³Department of Human Genetics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Center of Computational Medicine and Bioinformatics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Center for RNA Biomedicine, University of Michigan, Ann Arbor, ⁷A. Alfred Taubman Medical Research Institute, University of Michigan, Ann Arbor, ⁸Section of Ophthalmology, Surgery Service, Veterans Administration Ann Arbor Healthcare System

Transcript

כדי להתחיל, להוסיף 70 מיקרוליטר של חיץ מיזוג עבור כל מיליליטר של הפרה ללא תאים supernate של הומור העין. מערבבים היטב את חרוזי הניקוי כדי לערבב היטב. לאחר מכן, מוסיפים את החרוזים לדגימה, ואז מערבלים את המדגם ותערובות החרוזים.

צנטריפוגה זו מערבבת ב-3000 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. מבלי לפרוק את הכדור, לחלץ את supernate, ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של חיץ העיכול כדורי שתן לכדור. פיפטה את הפתרון למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את הכדור.

כעת הוסיפו פרוטאינאז K לתערובת הכדוריות המרחפות מחדש. לדגור על התערובת ב 55 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, ולאחר מכן להוסיף נפח שווה של חיץ ליזה גנומית לתערובת העיכול. מערבבים את התמיסה ביסודיות כדי לערבב אותה היטב.

כעת, מקם את עמודת הספין הזמינה מסחרית בשפופרת איסוף חדשה. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר הכנת DNA בשתן לעמודת הסחרור. צנטריפוגה ב 16, 000 G במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר להשליך את הזרימה.

כעת פיפטה 700 מיקרוליטר של DNA שתן לשטוף חיץ לעמוד וצנטריפוגה כפי שהודגם. לאחר השלכת הזרימה, העבר את עמודת הספין לצינור מיקרו צנטריפוגה ללא DNase. לבסוף, הוסף את הנפח המתאים של מאגר אלוציית הדנ"א ישירות למטריצת העמודה, ותן לו לשבת במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואז שוב צנטריפוגה כדי לקבל DNA ללא תאים.

תפוקות הדנ"א של רכיבים תאיים ונטולי תאים של נוזלי העיניים היו דומות. בוצע ניתוח PCR של המרכיבים התאיים ונטולי התאים של מוטציה הקשורה ללימפומה זגוגית. שיעור מוטציות גבוה יותר היה קיים ברכיב נטול התא, כפי שהודגם על ידי סף מחזור נמוך יותר.

Explore More Videos

Vitreoretinal Lymphoma

PCR Analysis

DNA Yield

Conditioning Buffer

Urine Pellet Digestion Buffer

Genomic Lysis Buffer

Urine DNA Prep Buffer