כדי להתחיל, הכנס תרבית תאים לתוך צלחת מתאם תרבית רקמה של 24 בארות. מצפים מראש את הצד האפי של התוספות עם 100 מיקרוליטר של קרום מרתף, מטריצה חוץ-תאית או BME במצע גידול אנטרואידי. יש לצפות תוספת נוספת לשימוש כבקרה במהלך מדידות שלמות המחסום.
לאחר מכן, לדגור על התוספת המצופה ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. לאחר השלמת הדגירה, שאפו את מדיום התרבית האנטרואידית התלת-ממדית. קצרו את אנטרואידים איליאליים של בקר במיליליטר אחד של אמצעי כביסה קרים כקרח.
השתמש במגרד תאים כדי לנתק את הכיפות ולאסוף אותן לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. עם קצה פיפטה של 1 מיליליטר, triturate 30 פעמים כדי ליצור שברים enteroid . לאחר מכן, השתמש קצה פיפטה 200 מיקרוליטר כדי triturate עוד כ 40 פעמים כדי לשבור את שברי enteroid .
לפצות את נפח הצינור ל 10 מיליליטר עם מדיה לשטוף קר כקרח. ואז צנטריפוגה את הצינור ב 300 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות לשאוף את supernatant, כולל שכבת BME.
לאחר מכן, עבור כל ארבע כיפות, יש להשהות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של אנזים TrypLE express שחומם מראש. מעבירים את התערובת לצלחת של 24 בארות ודגרים בחום של 37 מעלות מתחת ל-5% פחמן דו חמצני למשך 10 דקות. פיפטה עדינה את התערובת עם פיפטה 1 מיליליטר כדי לפרק עוד יותר את enteroids.
ואז פיפטה את התערובת עם פיפטה 200 מיקרוליטר כדי לשבור את השברים לתאים בודדים. השתמש מזרק 3 מיליליטר מצויד מחט סטרילית 22 מד כדי לשאוף ולחלק את תרחיף התא ארבע פעמים כדי להשיג תרחיף תא יחיד. בעזרת מיקרוסקופ, עקוב אחר דיסוציאציה של תאים עד ש-80% מהאנטרואידים מתפרקים לתאים בודדים.
עכשיו לאסוף את השעיית התא לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. הוסף ארבעה כרכים של מדיית שטיפת FBS כדי להרוות את התגובה. לאחר מכן מסננים את האנטרואידים דרך מסננת תאים מצופה מראש של 40 מיקרומטר פעמיים לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר.
צנטריפוגה את התרחיף ב 300 גרם במשך חמש דקות כדי להוציא את התאים. שאפו את הסופרנאטנט לתוך צינור הצנטריפוגה של תרחיף תאי אנטרואיד איליאלי מנותק. השהה מחדש את הגלולה בנפח קטן של מצע גידול אורגנואידים.
לאחר מכן, השתמש בשיטת אי הכללת הצבע הכחול Trypan ואת hemacytometer כדי לקבוע את כדאיות התא. יש להסיר בזהירות כל תמיסת ציפוי עודפת מתוספת תרבית התא. זרעו את 200 המיקרוליטרים של תרחיף התא הבודד על פני השטח האפי של תוספת תרבית מצופה מראש.
כעת הוסף 700 מיקרוליטר של מדיה מלאה FBS לצד הצדדי הבסיסי של העלון. הזיזו את הלוח בערך 10 פעמים בצורת הספרה שמונה כדי לפזר את התאים באופן שווה על פני העלון. לאחר מכן הניחו את הצלחת על מחמם הצלחת בארון הבטיחות הביולוגית למשך 10 דקות.
לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני לאחר 48 שעות. לאחר הדגירה, להחליף את התקשורת על רכיבים אפיים ובסיסיים עם מדיה צמיחה אנטרואידים טריים. למחרת, הסר את המדיה מהתאים הרוחביים האפיקליים והבסיסיים.
בזהירות לשטוף את הכנס עם PBS ולהחליף אותו עם הבחנה enteroid מדיה, בתוספת רק עם מעכבים. היווצרות אנטרוספירה נצפתה כמה שעות לאחר תרבית של קריפטים בקר מצופה. לאחר יומיים, לומן הספירות הוגדר היטב, עם ניצנים מבנים שנצפו ביום הרביעי.
אנטרואידים בוגרים נצפו עד היום השביעי. Immunostaining של אנטרואידים 3D בן שבעה ימים הראה נוכחות של שושלות תאים שונות. חלבון E-cadherin היה מקומי בצומת ההיצמדות.
האנטרואידים היו חיוביים לתאים אנטרואנדוקריניים ולתאי פאנת מייצרי ליזואנזים. חד-שכבות דו-ממדיות מתמזגות נצפו בפחות משבוע של תרבית.
