Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

כדי להתחיל, להכין צלחת agarose 1.8% עם HEPES Buffered E3 בינוני או E3. תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הניחו שישה עד 10 זחלים מורדמים בשורה על צלחת האגרוז. שים סיכת חרק אחת על הראש של כל זחל. לאחר מכן הסר את E3 הנותר מהצלחת באמצעות רקמה.

בעזרת סיכת חרק נוספת, בודדו את המעי מזחלים מבלי להפריע לאיברים אחרים. הקפידו על הסרה נכונה של החלמון. לאחר הבידוד, בדוק את המעי והסר את כל החומר שאינו מעיים, כגון עור, שומן או כבד.

השתמש בפינצטה כדי לאסוף את המעי ולהעביר אותו PBS המכיל 10% FCS בצינור מיקרוצנטריפוגה הממוקם על קרח. מיד לאחר הדיסקציה של כל המעיים, צנטריפוגה צינור microcentrifuge ב 13, 800 גרם במשך 30 שניות. הסר את supernatant, משאיר כ 100 מיקרוליטר בצינור כדי למנוע את המעיים להתייבש.

הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת פפאין למעיים בצינור. הפעל את פפאין על ידי הוספת 2.5 מיקרוליטר של ציסטאין מולארי אחד. לאחר מכן לדגור את הצינור המכיל את המעיים באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

פיפטה את התוכן למעלה ולמטה באמצע הדרך לאחר חמש דקות כדי לעורר עיכול רקמות אנזימטי. העבירו את התאים המנותקים לצינור מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות, או FACS, דרך מסננת תאים של 35 מיקרון. שטפו את המסננת מספר פעמים על ידי הוספת 0.5 מיליליטר PBS המכיל 10% FCS לנפח כביסה כולל של שני מיליליטר.

צנטריפוגו את התסנין שנאסף ב 700 גרם במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס, ולהסיר את supernatant. הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר DAPI ל- 300 מיקרוליטר של PBS המכיל 10% FCS. מוסיפים את התערובת לגלולה ומרחפים מחדש כדי לסמן את התאים המתים.

לאחר מכן יש לדגור במשך חמש דקות על קרח כדי לאפשר את הרחקתם במהלך ניתוח FACS שלאחר מכן.