Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

Please note that all translations are AI generated. Click here for the English version.

151 Views

•

02:37 min

•

November 10th, 2023

DOI :

10.3791/200882-v

November 10th, 2023

•

Christina M. Kaszuba¹^,², Benjamin J. Rodems¹^,³, Sonali Sharma¹^,³, Edgardo I. Franco¹^,², John M. Ashton¹^,³^,⁴, Laura M. Calvi¹^,⁵, Jeevisha Bajaj¹^,³

¹Wilmot Cancer Institute, University of Rochester Medical Center, ²Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, ³Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, ⁴Genomics Research Center, University of Rochester Medical Center, ⁵Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine, University of Rochester Medical Center

Transcript

כדי להתחיל, להסיר את הרקמה מן העצמות של העכבר מנותח המתת חסד. הניחו את העצמות המנוקות בצלחת חדשה בת שש בארות המכילה חיץ FACS המונח על קרח. מעבירים את העצמות למכתש עם שניים עד חמישה מיליליטר של חיץ FACS.

טוחנים את העצמות בתנועה סיבובית עד לשחרור מח העצם. בעזרת מזרק של שלושה מיליליטר, משכו למעלה ושטפו את מח העצם כדי להפוך אותו להומוגני. משוך את ההומוגנט לתוך מזרק אחר, ולאחר מכן לסנן אותו דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מיליליטר.

שטפו את גושי הרקמה מהמסנן שלהם בחזרה למכתש עם חיץ FACS לפני הומוגניזציה בפעם השנייה. סנן את הרקמה שטופה כמו קודם. לאחר מכן, שטפו את שאריות העצם בחזרה למכתש עם חיץ FACS.

לאחר מכן שטפו את החתיכות לתוך צינור 15 מיליליטר כדי להבטיח תפוקה מקסימלית. כדי לעכל את מח העצם, תחילה צנטריפוגו אותו ב 300 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. להשעות את גלולת מח העצם בשני מיליליטר של תערובת העיכול.

מעבירים את התערובת לצינור 15 מיליליטר. ואז לדגור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות על מסובב. כעת, הוסף 10 מיליליטר של מאגר FACS כדי לעצור את העיכול האנזימטי.

מסננים את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מיליליטר. צנטריפוגה את המתלה ב 400 G במשך שבע דקות בארבע מעלות צלזיוס. השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ ליזיס RBC.

לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של חיץ FACS כדי לעצור את הליזיס. לאחר מכן מסננים את התערובת כמו קודם לתוך צינור 50 מיליליטר. לבסוף, צנטריפוגו את התערובת ב 300 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר השלכת הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב -100 מיקרוליטר של חיץ FACS. לעיכול קוצים עצם, ראשית, מערבלים את קוצי העצם. דקרו את הסופרנאטנט ושמרו על העצמות בתחתית.

לאחר מכן, להשעות מחדש את spicules במיליליטר אחד של תערובת העיכול חריף עצם. לדגור את הצינור על מסובב במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לבסוף, לעצור את העיכול עם 10 מיליליטר של חיץ FACS.

מסננים את התערובת לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל RBC ליזה ומח עצם מעוכל.

Explore More Videos