ברצוננו להודות ל-URMC Flow Cytometry Core. עבודה זו נתמכה על ידי פרס האגודה האמריקאית להמטולוגיה, פרס הקרן לחקר לוקמיה ומענקים של NIH R01DK133131 ו-R01CA266617 שהוענקו לג'יי.בי.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת רוצ'סטר. עכברים גודלו והוחזקו במתקני הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת רוצ'סטר. כדי למדל MDS בסיכון גבוה, נעשה שימוש בדגם NHD13 murine19 הזמין מסחרית. במודל זה, תאי סטרומה של מח עצם מנותחים בנקבות עכברי NHD13 בגיל 8 שבועות, לפני הופעת המחלה. דה נובו AML נוצרכמתואר קודם 6,11,20. האונקוגנים המשמשים להשראת AML, כגון MLL-AF9 ו-NRas, מתויגים ב-GFP או YFP, ומאפשרים ניתוח של אוכלוסיות מח עצם GFP שאינן לוקמיות באמצעות ציטומטריית זרימה. בקצרה, נקבות עכברי C57BL/6J בנות 10 שבועות מושתלות עם תאי AML מורין GFP/YFP+, ומח העצם נקצר שבועיים לאחר ההשתלה. בעוד נקבות עכברים משמשות במחקר זה למטרות הדגמה, פרוטוקול זה יכול להתבצע עם עכברים זכרים או נקבות. זה יכול להתבצע גם באמצעות עצם הירך אחת או כל העצמות הארוכות.
1. קצירת מח עצם
הערה: לפרטים על פרוטוקול נתיחת בעלי חיים, עיין בתיקון ואח' 26.
<ol><li>נקו את הטיט והמזיק באתנול 70%, שטפו אותם עם חיץ FACS צונן (טבלה 1), והניחו אותם על קרח לקירור לפני תחילת הקציר. כמו כן, מקם חיץ MACs (טבלה 1) על הספסל כדי לאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות ולפרוטוקולים המוסדיים לטיפול ושימוש בבעלי חיים.</li>
	<li>על הספסל, ריססו היטב את העכבר באתנול 70% עד שפרוותו רטובה. בעזרת מלקחיים ומספריים מעוקלים, מרימים את העור על הבטן ומבצעים שני חתכים באורך של כ-0.5 מ"מ משני צידי העכבר, לרוחב מהבטן. לאחר מכן, לבצע חתך 0.5 מ"מ דיסטלי מן הבטן. משוך מטה כדי להסיר את העור והפרווה מרגלי העכבר.</li>
	<li>מניחים מספריים בניצב לאגן, לוחצים כלפי מטה תוך משיכה למעלה על עצם הירך עם מלקחיים. ראש עצם הירך צריך להתנתק מהאגן. להפריד את עצם הירך ואת השוקה במפרק patellofemoral. מניחים את העצמות בחיץ FACS בצלחת של 6 בארות על קרח.</li>
	<li>הסר רקמות מהעצמות באמצעות רקמה ברמת מעבדה והנח את העצמות המנוקות בצלחת חדשה בת 6 בארות עם חיץ FACS טרי על קרח.</li>
	<li>הכניסו את כל העצמות למכתש עם 2-5 מ"ל של חיץ FACS כך שכל העצמות יהיו שקועות במאגר (התאימו את נפח החיץ בהתאם למספר העצמות שאתם מעבדים). מרסקים וטוחנים את העצמות באמצעות המזיק בתנועה סיבובית עד שרקמת מח העצם משתחררת.</li>
	<li>באמצעות מזרק 3 מ"ל, הומוגניזציה של מח העצם על ידי משיכה למעלה ושטיפה למטה את הנוזל מן המליטה.</li>
	<li>באמצעות מזרק 3 מ"ל, למשוך את הנוזל מן המליטה ולסנן אותו דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל על קרח. שטפו את גושי העצם/רקמה מהמסנן בחזרה למכתש עם חיץ FACS וחזרו לשלב 1.7 כדי ליצור הומוגניות ולסנן פעם נוספת. זה מהווה את חלק מח העצם.</li>
	<li>שטפו את חתיכות העצם הנותרות (קוצים) בחזרה למכתש עם חיץ FACS ושטפו אותן לתוך צינור של 15 מ"ל באמצעות מאגר FACS כדי להבטיח תפוקת תאים מרבית. זהו שבר קוצי העצם.</li>
</ol>2. עיכול מח עצם
<ol><li>צנטריפוגה את מח העצם ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. דקאנט והשליך את הסופר-נטנט.</li>
	<li>השהה מחדש את מח העצם ב-2 מ"ל של תערובת עיכול מח העצם (טבלה 1) והעבר אותו לצינור של 15 מ"ל. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 45 דקות על מסובב.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS כדי לעצור את העיכול האנזימטי. סנן את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל.</li>
	<li>מזלפים את התערובת ב 400 x גרם במשך 7 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>השהה מחדש את גלולת מח העצם ב 1 מ"ל של חיץ ליזה RBC (ראה טבלת חומרים). דוגרים במשך 4 דקות על קרח.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS כדי לעצור את הליזיס. סנן את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 50 מ"ל.</li>
	<li>מזלפים את התערובת ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 100 μL של חיץ FACS.</li>
</ol>3. עיכול של קוצים עצם
<ol><li>מערבלים את קוצי העצם משלב 1.9 ומאפשרים להם להתיישב. דקרו את הסופרנאטנט ושמרו על העצם בתחתית.</li>
	<li>השהה מחדש את קוצי העצם ב-1 מ"ל של תערובת העיכול המתובלת של העצם (טבלה 1).</li>
	<li>הניחו את הצינורות על מסובב צינור למשך 60 דקות בטמפרטורה של 37°C.</li>
	<li>הוסף 10 מ"ל של חיץ FACS כדי לעצור את העיכול האנזימטי. סננו את התערובת דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל המכיל מח עצם מעוכל ומעוכל RBC.</li>
</ol>4. צביעה
<ol><li>מערבבים בעדינות את קוצי העצם ואת תרחיף תאי מח העצם.</li>
	<li>השתמש ב- 10 μL של תרחיף התא כדי לספור את מספר התא החי על המוציטומטר באמצעות צביעה על בסיס כחול טריפאן 0.4%, כמתואר בפרוטוקוליםשפורסמו 27. אסוף 50,000 תאים לבקרה לא מוכתמת מהשעיית התא.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים הנותרים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו resuspend אותם ב 100 μL של מאגר FACS. הערה: נוגדנים יכולים להיות titrated כדי לקבוע את דילול אידיאלי. בחירת נוגדנים (אפיטופים ופלואורוכרומים) ניתנת להתאמה אישית.</li>
	<li>לצביעה עם נוגדנים לדלדול מגנטי, הוסף בלוק FC (1 μL לכל 25 x 106 תאים), CD45-APC (10 μL לכל 25 x 106 תאים) ו- Ter119-APC (4 μL לכל 25 x 106 תאים) (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>דוגרים על קרח במשך 20 דקות. יש לשטוף עם מאגר FACS, להסיר 50,000 תאים (~ 50 μL) עבור הבקרה המוכתמת APC, צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, והשהיה מחדש ב 100 μL של מאגר FACS.</li>
	<li>לצביעת תרחיף התא במיקרו-כדוריות לדלדול מגנטי, הוסף mIgG (8 μL לכל 25 x 106 תאים) ומיקרו-כדוריות נגד APC (20 μL לכל 25 x 106 תאים) (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>דוגרים על קרח במשך 20 דקות. יש לשטוף עם מאגר FACS של 10 מ"ל, צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.</li>
</ol>5. דלדול הדגימה על ידי מיון מגנטי
הערה: שלב זה מתבצע באמצעות מפריד מגנטי ידני הזמין מסחרית בהתאם להוראות היצרן. ניתן לבצע שלב זה גם באמצעות מפריד אוטומטי (ראה טבלת חומרים).
<ol><li>הכן את עמודת LD על-ידי שטיפתה עם 2 מ"ל של מאגר MACs (טבלה 1). יש להשליך את הקולחים ולהחליף את צינור האיסוף.</li>
	<li>השהה מחדש עד 1 x 108 תאים במאגר MACs וסנן אותם דרך מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר.</li>
	<li>הניחו את עמוד ה-LD על מעמד המפריד המגנטי. מקם מבחנה של 5 מ"ל מתחת לעמודה כדי לאסוף את הפולט.</li>
	<li>הוסף את מתלה התא לעמודת LD המוכנה. אפשר לחלק השלילי לזרום דרך צינור האיסוף. לשטוף את העמודה פעמיים עם 1 מ"ל של מאגר MACs, איסוף eluate באותו צינור. זהו החלק השלילי המשמש בשלב 5.6 להלן.</li>
	<li>הסר את עמוד LD מהמעמד המפריד המגנטי והנח אותו על מבחנה חדשה של 5 מ"ל. השתמש פיפטה כדי לחלק 3 מ"ל של מאגר לתוך העמודה כדי לשטוף החוצה תאים שסומנו באופן חיובי, באמצעות בוכנה עמודה.</li>
	<li>צנטריפוגה את השברים השליליים והחיוביים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השהה אותם מחדש ב- 100 μL של מאגר FACS.</li>
	<li>ספירת 10 μL של השברים השליליים והחיוביים עם 0.4% כחול טריפאן. הנפחים עבור ניתוח אוסטאו-אנליזה/צביעת פאנל אנדותל להלן יתבססו על ספירת תאים זו.</li>
	<li>השתמש ב- 50,000 תאים חיים מהחלק החיובי עבור בקרות gating ציטומטריית זרימה.</li>
</ol>6. ניתוח אוסטאו/כתם בלוח האנדותל
הערה: יש לבצע את הפיצוי בהתאם לפרוטוקולי ציטומטריית זרימה סטנדרטיים, כולל כל בקרות הצביעה והגטינג המתאימות.
<ol><li>עבור צביעה של החלק השלילי CD45 / Ter119 (1 μL של כל נוגדן לכל 1 x 106 תאים), להוסיף CD31-PE-Cy7, Sca-1-BV421, CD51-PE ו- CD140a-PE-Cy5 (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>דוגרים על קרח במשך 20 דקות. יש לשטוף עם 2 מ"ל של מאגר FACS, ולאחר מכן לצנטריפוגה במהירות 300 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של חיץ FACS ודילול 1:1000 של PI עבור צביעה חיה/מתה, ולאחר מכן סנן את הדגימה דרך מבחנה של 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים של 35 מיקרומטר.</li>
	<li>נתח את התאים בציטומטר זרימה מרובה צבעים.</li>
</ol>

בידוד ואפיון מיקרו-סביבה של מח עצם בגידולים מיאלואידים

<ol>
	<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li><li>Boulais, P. E., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+sense+of+hematopoietic+stem+cell+niches.">Making sense of hematopoietic stem cell niches.</a> Blood. 125 (17), 2621-2629 (2015).</li><li>Pinho, S., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haematopoietic+stem+cell+activity+and+interactions+with+the+niche.">Haematopoietic stem cell activity and interactions with the niche.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (5), 303-320 (2019).</li><li>Kfoury, Y., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+contributions+to+the+stem+cell+niche.">Mesenchymal cell contributions to the stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 239-253 (2015).</li><li>Itkin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+bone+marrow+blood+vessels+differentially+regulate+haematopoiesis.">Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis.</a> Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).</li><li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cd98-mediated+adhesive+signaling+enables+the+establishment+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia.">Cd98-mediated adhesive signaling enables the establishment and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cancer Cell. 30 (5), 792-805 (2016).</li><li>Konopleva, M. Y., Jordan, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukemia+stem+cells+and+microenvironment:+Biology+and+therapeutic+targeting.">Leukemia stem cells and microenvironment: Biology and therapeutic targeting.</a> J Clin Oncol. 29 (5), 591-599 (2011).</li><li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+notch+activation+in+microenvironment+leads+to+myeloproliferative+disease.">Defective notch activation in microenvironment leads to myeloproliferative disease.</a> Blood. 112 (12), 4628-4638 (2008).</li><li>Walkley, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microenvironment-induced+myeloproliferative+syndrome+caused+by+retinoic+acid+receptor+gamma+deficiency.">A microenvironment-induced myeloproliferative syndrome caused by retinoic acid receptor gamma deficiency.</a> Cell. 129 (6), 1097-1110 (2007).</li><li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+&#946;-catenin+mutation+in+osteoblasts.">Leukaemogenesis induced by an activating &#946;-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li><li>Hanoun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myelogenous+leukemia-induced+sympathetic+neuropathy+promotes+malignancy+in+an+altered+hematopoietic+stem+cell+niche.">Acute myelogenous leukemia-induced sympathetic neuropathy promotes malignancy in an altered hematopoietic stem cell niche.</a> Cell Stem Cell. 15 (3), 365-375 (2014).</li><li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia.">Bone progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li><li>Frisch, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+inhibition+of+osteoblastic+cells+in+an+in+vivo+mouse+model+of+myeloid+leukemia.">Functional inhibition of osteoblastic cells in an in vivo mouse model of myeloid leukemia.</a> Blood. 119 (2), 540-550 (2012).</li><li>Bajaj, J., Diaz, E., Reya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+cancer+initiation+and+progression.">Stem cells in cancer initiation and progression.</a> J Cell Biol. 219 (1), e201911053 (2020).</li><li>Sekeres, M. A., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+treatment+of+myelodysplastic+syndromes:+A+review.">Diagnosis and treatment of myelodysplastic syndromes: A review.</a> Jama. 328 (9), 872-880 (2022).</li><li>Zeisig, B. B., Kulasekararaj, A. G., Mufti, G. J., So, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snapshot:+Acute+myeloid+leukemia.">Snapshot: Acute myeloid leukemia.</a> Cancer Cell. 22 (5), 698-698.e1 (2012).</li><li>Krivtsov, A. V., Armstrong, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mll+translocations,+histone+modifications+and+leukaemia+stem-cell+development.">Mll translocations, histone modifications and leukaemia stem-cell development.</a> Nat Rev Cancer. 7 (11), 823-833 (2007).</li><li>Yoshimi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+alterations+in+rna+splicing+and+epigenetic+regulation+drive+leukaemogenesis.">Coordinated alterations in rna splicing and epigenetic regulation drive leukaemogenesis.</a> Nature. 574 (7777), 273-277 (2019).</li><li>Lin, Y. W., Slape, C., Zhang, Z., Aplan, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nup98-hoxd13+transgenic+mice+develop+a+highly+penetrant,+severe+myelodysplastic+syndrome+that+progresses+to+acute+leukemia.">Nup98-hoxd13 transgenic mice develop a highly penetrant, severe myelodysplastic syndrome that progresses to acute leukemia.</a> Blood. 106 (1), 287-295 (2005).</li><li>Kwon, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetraspanin+3+is+required+for+the+development+and+propagation+of+acute+myelogenous+leukemia.">Tetraspanin 3 is required for the development and propagation of acute myelogenous leukemia.</a> Cell Stem Cell. 17 (2), 152-164 (2015).</li><li>Bajaj, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+genome-wide+crispr+screen+identifies+the+rna-binding+protein+staufen2+as+a+key+regulator+of+myeloid+leukemia.">An in vivo genome-wide crispr screen identifies the rna-binding protein staufen2 as a key regulator of myeloid leukemia.</a> Nat Cancer. 1 (4), 410-422 (2020).</li><li>Krivtsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+from+committed+progenitor+to+leukaemia+stem+cell+initiated+by+mll-af9.">Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by mll-af9.</a> Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).</li><li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia.">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932.e16 (2019).</li><li>Tikhonova, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+microenvironment+at+single-cell+resolution.">The bone marrow microenvironment at single-cell resolution.</a> Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).</li><li>Balderman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+the+bone+marrow+microenvironment+improves+outcome+in+a+murine+model+of+myelodysplastic+syndrome.">Targeting of the bone marrow microenvironment improves outcome in a murine model of myelodysplastic syndrome.</a> Blood. 127 (5), 616-625 (2016).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> JoVE. 110, e53936 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> , (2023).</li><li>Passaro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+vascular+permeability+in+the+bone+marrow+microenvironment+contributes+to+acute+myeloid+leukemia+progression+and+drug+response.">Increased vascular permeability in the bone marrow microenvironment contributes to acute myeloid leukemia progression and drug response.</a> Blood. 128 (22), 2662 (2016).</li><li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+factor+is+selectively+secreted+by+arterial+endothelial+cells+in+bone+marrow.">Stem cell factor is selectively secreted by arterial endothelial cells in bone marrow.</a> Nat Commun. 9 (1), 2449 (2018).</li><li>Baccin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+single-cell+and+spatial+transcriptomics+reveal+the+molecular,+cellular+and+spatial+bone+marrow+niche+organization.">Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization.</a> Nat Cell Biol. 22 (1), 38-48 (2020).</li><li>Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, M., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+two+digestion+strategies+on+characteristics+and+differentiation+potential+of+human+dental+pulp+stem+cells.">Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells.</a> Arch Oral Biol. 93, 74-79 (2018).</li><li>Abreu-Velez, A. M., Howard, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+IV+in+normal+skin+and+in+pathological+processes.">Collagen IV in normal skin and in pathological processes.</a> N Am J Med Sci. 4 (1), 1-8 (2012).</li></ol>

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

מודלים של לוקמיה מורנית שימשו באופן נרחב לזיהוי אותות פנימיים ונישתיים של תאים המקדמים התקדמות לוקמיה מיאלואידית אגרסיבית 6,19,21. כאן מוצג פרוטוקול מקיף מבוסס ציטומטריית זרימה להגדרת ההרכב התאי של מיקרו-סביבה של מח העצם במודלים של MDS ו-AML.</...

המיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מתאים המטופויטיים, תאי סטרומה לא המטופויטיים והמטריצה החוץ תאית 1,2. מיקרו-סביבה זו יכולה לקדם התחדשות עצמית של תאי גזע המטופויטיים, לווסת התמיינות שושלת ולספק תמיכה מבנית ומכנית לרקמת העצם 1,2,3,4,5. נישת הסטרומה כוללת תאי אוסטאו-שושלת, פיברובלסטים, תאי עצב ותאי אנדותל6, בעוד שהנישה ההמטופויטית מורכבת מאוכלוסיות הלימפה והמיאלואידים 1,2,3. בנוסף לתמיכה ב-HSCs נורמליים, מיקרו-סביבה של מח העצם יכולה גם למלא תפקיד בהתפתחות של הפרעות תאי גזע המטופויטיים כגון MDS ו-AML 7,8,9,10,11. מוטציות בתאי אוסטאו-שושלת הוכחו כמקדמות התפתחות של MDS, AML וגידולים מיאלופרוליפרטיביים אחרים 10,12,13,14.
תסמונות מיאלודיספלסטיות הן קבוצה של הפרעות טרום לוקמיות הנובעות ממוטציות בתאי גזע המטופויטיים. MDS קשור לעתים קרובות עם בלוק בהתמיינות HSC וייצור של תאים דיספלסטיים, אשר לעתים קרובות יכול להוביל לאי ספיקת מח עצם. MDS הוא הניאופלזמה המיאלואידית המאובחנת הנפוצה ביותר בארצות הברית והוא קשור לשיעור הישרדות של 3 שנים של 35%-45%15. MDS קשור לעתים קרובות עם סיכון גבוה של טרנספורמציה לוקמיה מיאלואידית חריפה. זה יכול להיות סיבוך קטלני, שכן AML נגזר MDS עמיד לרוב הטיפולים וסביר להניח להישנות. AML המתעורר דה נובו עקב טרנסלוקציות או מוטציות בגזע hematopoietic ואבות הוא גם עמיד לעתים קרובות כימותרפיה סטנדרטית16,17. מכיוון ש- MDS ו- AML הן בעיקר מחלות של קשישים, כאשר רובם מאובחנים מעל גיל 60 שנה, רוב החולים אינם כשירים להשתלת מח עצם מרפאת. יש, אם כן, צורך משמעותי לזהות רגולטורים חדשים של התקדמות המחלה. מכיוון שהמיקרו-סביבה של מח העצם יכולה לספק תמיכה לתאים ממאירים14, הגדרת שינויים בנישת מח העצם עם התקדמות המחלה עשויה להוביל לזיהוי טיפולים חדשניים שמטרתם לעכב עיצוב מחדש של נישת הגידול. יש, אם כן, צורך משמעותי לזהות רגולטורים חדשים של התקדמות המחלה. לשם כך, קריטי לזהות ולאפיין שינויים באוכלוסיית תאי הסטרומה של מח העצם שעשויים לספק תמיכה לתאים הממאירים.
מספר מודלים של AML ו- MDS נוצרו וניתן להשתמש בהם כדי לחקור שינויים במיקרו-סביבה של מח העצם במהלך התחלת המחלה והתקדמותה 6,1,19,20,21,22. כאן, מתוארים פרוטוקולים לזיהוי שינויים באוכלוסיית תאי סטרומה של מח העצם באמצעות מודלים מורינים של AML 6,20 המושרה רטרו-ויראלית, כמו גם מודל Nup98-HoxD13 (NHD13) הזמין מסחרית של MDS בסיכון גבוה לשינוי AML19. עכברים שהושתלו בהם תאי AML דה נובו נכנעים למחלה תוך 20-30 יום6. עכברי NHD13 מפתחים ציטופניה ודיספלסיה של מח עצם בסביבות 15-20 שבועות, אשר בסופו של דבר הופכת ל-AML, וכמעט 75% מהעכברים נכנעים למחלה בסביבות 32 שבועות. כדי לנתח את אוכלוסיות המיקרו-סביבה של מח עצם מודל מורין, עצמות נקצרות, מח עצם וקוצים עצם מתעכלים באמצעות עיכול אנזימטי, ולאחר מכן התאים מועשרים עבור CD45-/Ter119- אוכלוסיות שאינן המטופויטיות על ידי מיון מגנטי. בעוד שניתוחים דומים תוארו בעבר 11,13,22,23,24,25, הם מתמקדים לעתים קרובות במח העצם או בעצם ואינם משלבים תאים משני המקורות בניתוחים שלהם. האפיון המשולב של האוכלוסיות האלה, בשילוב עם ניתוחי ביטוי גנים, יכול לספק הבנה מקיפה של האופן שבו המיקרו-סביבה ההמטופויטית התאית מספקת תמיכה להתחלת מחלות והתקדמותן (איור 1). בעוד שהפרוטוקול המתואר להלן מתמקד במודל AML המושרה רטרו-ויראלית ובמודל MDS גנטי, ניתן להתאים אסטרטגיות אלה בקלות לחקר שינויים בנישת מח העצם של כל מודל מורין מעניין.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL pipette Tips&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-165RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>AVANT</td>
			<td>L211511-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-140RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Vacuum Filtration Flask</td>
			<td>NEST</td>
			<td>344021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10026-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Aspirating Pipette</td>
			<td>NEST</td>
			<td>325011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L pipette Tips</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>24-150-RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes</td>
			<td>Globe scientific</td>
			<td>1740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube&#160; 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier</td>
			<td>VWR</td>
			<td>56616-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi&#160;</td>
			<td>130-090-855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>4425745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td>0.5 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>66.000 g/mol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>404-5981</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Dioxide Gas Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25-0311-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-0451-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 &#181;m Nylon&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-63100-62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5138-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type I</td>
			<td>STEMCELL</td>
			<td>7415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Mini Centrifuge</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Stripettor Ultra Pipet Controller</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>117105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14200-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>00-4333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foundation B Fetal Bovine Serum</td>
			<td>GeminiBio</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson&#160;PIPETMAN L Pipette Starter Kits</td>
			<td>FisherScientific&#160;</td>
			<td>F167370G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS) 10x</td>
			<td>gibco</td>
			<td>14185-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-671-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator&#160;</td>
			<td>BINDER</td>
			<td>C150-UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>KIMTECH</td>
			<td>K222101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-425-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LD Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSE Vortex Mixer</td>
			<td>CORNING</td>
			<td>6775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRII/Fortessa/Symphony A1</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>647800L6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MULTI STAND&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACsmix Tube Rotator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mIgG</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>18765-10mg</td>
			<td>2 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice</td>
			<td>Jackson Laboratory&#160;</td>
			<td>010505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104106</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>135920</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastipak 3 mL Syringe</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS&#160; Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec GmBH</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75009521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17-5921-82</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution 0.4%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying bone marrow microenvironmental populations in myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia

מיקרו-סביבה של מח העצם מורכבת מאוכלוסיות תאים נפרדות, כגון תאי סטרומה מזנכימליים, תאי אנדותל, תאי אוסטאו-שושלת ופיברובלסטים, המספקים תמיכה לתאי גזע המטופויטיים (HSC). בנוסף לתמיכה ב-HSC תקין, מיקרו-סביבה של מח העצם ממלאת גם תפקיד בהתפתחות הפרעות תאי גזע המטופויאטיות, כגון תסמונות מיאלודיספלסטיות (MDS) ולוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). מוטציות הקשורות ל- MDS ב- HSCs מובילות לחסימה בהתמיינות ואי ספיקת מח עצם מתקדמת, במיוחד אצל קשישים. MDS יכול לעתים קרובות להתקדם AML עמיד לטיפול, מחלה המאופיינת על ידי הצטברות מהירה של פיצוצים מיאלואידים לא בוגרים. מיקרו-סביבה של מח העצם ידועה כמשתנה בחולים עם גידולים מיאלואידים אלה. כאן מתואר פרוטוקול מקיף לבידוד ואפיון פנוטיפי של תאים מיקרו-סביבתיים של מח עצם ממודלים מורינים של תסמונת מיאלודיספלסטית ולוקמיה מיאלואידית חריפה. בידוד ואפיון שינויים באוכלוסיית נישות מח העצם יכול לסייע בקביעת תפקידם בהתחלת המחלה והתקדמותה, ועשוי להוביל לפיתוח טיפולים חדשניים המתמקדים בשינויים מקדמי סרטן באוכלוסיית סטרומה מח העצם.

The bone marrow microenvironment consists of hematopoietic cells, non-hematopoietic stromal cells, and the extracellular matrix1,2. This microenvironment can promote hematopoietic stem cell self-renewal, regulate lineage differentiation, and provide structural and mechanical support to the bone tissue1,2,3,4,5. The stromal niche includes osteolineage cells, fibroblasts, nerve cells, and endothelial cells6, while the hematopoietic niche consists of the lymphoid and myeloid populations1,2,3. In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment can also play a role in the development of hematopoietic stem cell disorders such as MDS and AML7,8,9,10,11. Mutations in osteolineage cells have been shown to promote the development of MDS, AML, and other myeloproliferative neoplasms10,12,13,14.
Myelodysplastic syndromes are a group of pre-leukemic disorders that arise from mutations in hematopoietic stem cells. MDS is frequently associated with a block in HSC differentiation and the production of dysplastic cells, which can often lead to bone marrow failure. MDS is the most commonly diagnosed myeloid neoplasm in the United States and is associated with a 3-year survival rate of 35%-45%15. MDS is often associated with a high risk of transformation to acute myeloid leukemia. This can be a fatal complication, as MDS-derived AML is resistant to most therapies and likely to relapse. AML that arises de novo due to translocations or mutations in hematopoietic stem and progenitors is also often resistant to standard chemotherapy16,17. Since MDS and AML are primarily diseases of the elderly, with the majority diagnosed over the age of 60 years, most patients are ineligible for curative bone marrow transplants. There is, thus, a significant need to identify novel regulators of disease progression. Since the bone marrow microenvironment can provide support for malignant cells14, defining changes in the bone marrow niche with disease progression may lead to the identification of novel therapeutics aimed at inhibiting tumor niche remodeling. There is, therefore, a significant need to identify novel regulators of disease progression. To this end, it is critical to identify and characterize changes in the bone marrow stromal cell populations that may provide support for the malignant cells.
Several murine models of AML and MDS have been generated and can be used to study changes in the bone marrow microenvironment during disease initiation and progression6,1,19,20,21,22. Here, protocols to identify changes in the bone marrow stromal cell populations using murine models of retrovirally induced AML6,20, as well as the commercially available Nup98-HoxD13 (NHD13) model of high-risk MDS to AML transformation19, are described. Mice transplanted with de novo AML cells succumb to the disease in 20-30 days6. The NHD13 mice develop cytopenias and bone marrow dysplasia around 15-20 weeks, which eventually transforms into AML, and nearly 75% of the mice succumb to the disease around 32 weeks. To analyze the murine model bone marrow microenvironment populations, bones are harvested, bone marrow and bone spicules are digested using enzymatic digestion, and the cells are then enriched for CD45-/Ter119- non-hematopoietic populations by magnetic sorting. While similar analyses have been previously described11,13,22,23,24,25, they often focus on either the bone marrow or the bone and do not incorporate cells from both sources in their analyses. The combined characterization of these populations, in conjunction with gene expression analyses, can provide a comprehensive understanding of how the cellular hematopoietic microenvironment provides support for disease initiation and progression (Figure 1). While the protocol described below focuses on retrovirally induced AML model and a genetic MDS model, these strategies can be easily adapted to study changes in the bone marrow niche of any murine model of interest.

מחבר זרקור: ניתוח מיקרו-סביבה של מח עצם בממאירויות המטולוגיות מורין 

זיהוי אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם בתסמונת מיאלודיספלסטית ובלוקמיה מיאלואידית חריפה

Our research aims to explore how the bone marrow's changing environment influences tumor growth. We developed a flow cytometry protocol to analyze the non-immune cells in bone marrow and bone tissues, focusing on murine hematological malignancies. This method is adaptable for studying bone marrow in various murine models.Our study focuses on isolating and identifying alterations in bone marrow stromal populations during cancer progression. Understanding their impact on disease onset and advancement could pave the way for new treatments that target these cancer-facilitating changes in the bone marrow stromal cells. Our protocol uniquely combines mechanical and enzymatic digestions, magnetic depletions, and flow cytometry to delineate the bone marrow microenvironment cellular makeup.It stands out by employing magnetic separation and incorporating cells from both bone and marrow, offering a more comprehensive representation of this microenvironment.

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ציטומטריית זרימה לניתוח אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם, כגון תאי אנדותל ותאי סטרומה מזנכימליים, ממודלים של MDS ולוקמיה מורין (איור 1). איור 2 מתאר את אסטרטגיית ה-gating לזיהוי אוכלוסיות מעניינות, החל מבחירת התאים (P1) במקטע המעוכל והמדו...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Bone Marrow Microenvironment in Murine Hematological Malignancies at JoVE.com

כאן מוצג פרוטוקול מפורט לבידוד ואפיון אוכלוסיות מיקרו-סביבתיות של מח עצם ממודלים של תסמונות מיאלודיספלסטיות ולוקמיה מיאלואידית חריפה. טכניקה זו מזהה שינויים בנישת מח העצם הלא המטופויטית, כולל תאי האנדותל והסטרומה המזנכימליים, עם התקדמות המחלה.

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and ...

מטרת המחקר שלנו היא לחקור כיצד הסביבה המשתנה של מח העצם משפיעה על צמיחת הגידול. פיתחנו פרוטוקול ציטומטריית זרימה לניתוח התאים הלא-חיסוניים במח העצם וברקמות העצם, תוך התמקדות בממאירויות המטולוגיות מורין. שיטה זו ניתנת להתאמה לחקר מח עצם במודלים שונים של מורין.המחקר שלנו מתמקד בבידוד וזיהוי שינויים באוכלוסיות סטרומה של מח עצם במהלך התקדמות סרטן. הבנת השפעתם על התפרצות המחלה והתקדמותה עשויה לסלול את הדרך לטיפולים חדשים המכוונים לשינויים אלה המאפשרים סרטן בתאי סטרומה של מח העצם. הפרוטוקול שלנו משלב באופן ייחודי עיכול מכני ואנזימטי, דלדולים מגנטיים וציטומטריית זרימה כדי לשרטט את המבנה התאי של מח העצם.הוא בולט על ידי שימוש בהפרדה מגנטית ושילוב תאים הן מהעצם והן מהמח, ומציע ייצוג מקיף יותר של מיקרו-סביבה זו.

identifying-bone-marrow-microenvironmental-populations

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identifying Bone Marrow Microenvironmental Populations in Myelodysplastic Syndrome and Acute Myeloid Leukemia

805 Views.  University of Rochester Medical Center. מטרת המחקר שלנו היא לחקור כיצד הסביבה המשתנה של מח העצם משפיעה על צמיחת הגידול. פיתחנו פרוטוקול ציטומטריית זרימה לניתוח התאים הלא-חיסוניים במח העצם וברקמות העצם, תוך התמקדות בממאירויות המטולוגיות מורין. שיטה זו ניתנת להתאמה לחקר מח עצם במודלים שונים של מורין.המחקר שלנ?...

Video: מחבר זרקור: ניתוח מיקרו-סביבה של מח עצם בממאירויות המטולוגיות מורין 

The bone marrow microenvironment consists of distinct cell populations, such as mesenchymal stromal cells, endothelial cells, osteolineage cells, and fibroblasts, which provide support for hematopoietic stem cells (HSCs). In addition to supporting normal HSCs, the bone marrow microenvironment also plays a role in the development of hematopoietic stem cell disorders, such as myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukemia (AML). MDS-associated mutations in HSCs lead to a block in differentiation and progressive bone marrow failure, especially in the elderly. MDS can often progress to therapy-resistant AML, a disease characterized by a rapid accumulation of immature myeloid blasts. The bone marrow microenvironment is known to be altered in patients with these myeloid neoplasms. Here, a comprehensive protocol to isolate and phenotypically characterize bone marrow microenvironmental cells from murine models of myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia is described. Isolating and characterizing changes in the bone marrow niche populations can help determine their role in disease initiation and progression and may lead to the development of novel therapeutics targeting cancer-promoting alterations in the bone marrow stromal populations.

Here a detailed protocol to isolate and characterize bone marrow microenvironmental populations from murine models of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia is presented. This technique identifies changes in the non-hematopoietic bone marrow niche, including the endothelial and mesenchymal stromal cells, with disease progression.

Murine Bone Marrow Harvest and Isolation for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment 

To begin, remove the tissue from the bones of the euthanized dissected mouse. Place the cleaned bones into a new six-well plate containing FACS buffer placed on ice. Transfer the bones into a mortar with two to five milliliters of FACS buffer.Grind the bones in a circular motion until the bone marrow is released. With a three milliliter syringe, pull up and flush down the bone marrow to homogenize it. Pull the homogenate into another syringe, then filter it through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube.Rinse the tissue chunks from their filter back into the mortar with FACS buffer before homogenizing a second time. Filter the rinsed tissue as before. Next, rinse the remaining bone spicules back into the mortar with FACS buffer.Then flush the pieces into a 15 milliliter tube to ensure maximum yield. To digest the bone marrow, first centrifuge it at 300 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the bone marrow pellet in two milliliters of digestion mixture.Transfer the mixture to a 15 milliliter tube. Then incubate it at 37 degrees Celsius for 45 minutes on a rotator. Now, add 10 milliliters of FACS buffer to stop the enzymatic digestion.Filter the mixture through a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter tube. Centrifuge the suspension at 400 G for seven minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in one milliliter of RBC lysis buffer.Next, add 10 milliliters of FACS buffer to halt the lysis. Then filter the mixture as before into a 50 milliliter tube. Lastly, centrifuge the mixture at 300 G for five minutes at four degrees celsius.After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. For the digestion of bone spicules, first, vortex the bone spicules. Decant the supernatant and retain the bones at the bottom.Next, resuspend the spicules in one milliliter of the bone spicule digestion mixture. Incubate the tube on a rotator for 60 minutes at 37 degrees Celsius. Finally, stop the digestion with 10 milliliters of FACS buffer.Filter the mixture into the 50 milliliter tube containing RBC lysed and digested bone marrow.

קציר מח עצם מורין ובידוד לאפיון מיקרו-סביבה של לוקמיה מיאלואידית 

Murine Bone Marrow Staining for the Characterization of Myeloid Leukemia Microenvironment

To begin, mix the isolated murine bone marrow suspension with the bone spicule suspension. Pipette 10 microliters of the cell suspension onto a hemocytometer for counting. Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes at four degrees Celsius.Then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cells with antibodies for magnetic depletion, add FC block, CD45 APC, and TER-119 APC. Then wash the cell suspension with FACS buffer.After centrifuging the remaining mixture, resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the cell suspension with microbeads for magnetic depletion, add mouse IgG and anti-APC microbeads. Incubate the mixture on ice for 20 minutes.Wash the LD column with two milliliters of MACS buffer. Resuspend the cells in the buffer, then filter it through a five milliliter test tube with a 35 micrometer cell strainer cap. Next, set the LD column on the magnetic separator stand and place a five milliliter test tube under the column to collect the eluted material.Pipette the cell suspension into the LD column and collect the negative fraction flow through in the test tube. Wash the column two times with one milliliter of MACS buffer and collect the eluent material in the same tube. Place the LD column over a new five milliliter test tube.With a pipette, dispense three milliliters of buffer into the column, then flush out the positively labeled cells into a five milliliter test tube. Centrifuge both the positive and negative fractions, then resuspend the pellet in 100 microliters of FACS buffer. To stain the CD45 TER-119 negative fraction add one microliter of each antibody for every 10 to the sixth cells.Place the suspension on ice for 20 minutes. Then wash the suspension with two milliliters of FACS buffer before centrifuging. Add one milliliter of the buffer to the pellet and pipette propidium iodide for live cell staining.Finally, filter the sample through a 35 micrometer cell strainer into a five milliliter test tube before analyzing the cells on a multicolor flow cytometer. Arteriolar endothelial cells significantly expanded in the acute myeloid leukemia microenvironment with a concomitant loss in the sinusoidal endothelial populations. A small expansion in the mesenchymal stromal cells were seen at eight weeks of age.