כדי להתחיל, להגדיר את הפרמטרים של תחנת פיפטה להציב מכסה המנוע זרימה למינרית ל 1, 900 וולט, 20 אלפיות השנייה בפעימה אחת. בזהירות להסיר צינור transfection מן החבילה כדי לשמור אותו סטרילי ולמלא אותו עם שלושה מיליליטר של מאגר E. כדי להכין את התאים להתחשמלות, הסירו את מצע הגידול מהתאים ושטפו אותם באמצעות PBS כדי להסיר את הסרום ואת הקטיונים הדו-ערכיים המעודדים הידבקות.
לאחר מכן מוסיפים תערובת של PBS ו-EDTA של מילימולר אחד לתאים ודגרים בטמפרטורת החדר במשך כחמש דקות עד שהתאים מתחילים להתנתק. פיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לנתק את התאים ולהעביר את התאים לצינור 15 מיליליטר קושר חלבון נמוך. גלולה את התאים ב 500 גרם במשך חמש דקות.
לאחר הצנטריפוגה מוציאים במהירות את רוב הסופרנאטנט, ומשאירים כמיליליטר אחד של הסופרנאטנט בצינור. מרחפים מחדש את התאים בסופרנאטנט הנותר ומעבירים אותו לצינור מיקרופוגה 1.5 מיליליטר קושר חלבון נמוך. הסר aliquot קטן של תאים כדי לספור ו pellet את התאים הנותרים על ידי צנטריפוזיה ב 500 G בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות.
ספרו את התאים במהלך הצנטריפוגה. קח 1x sgRNA בתמיסת Cas9 20 מילימולרית וחמם את הצינורות לטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, הסר את כל הסופרנאטנט מכדורית התא והשהה מחדש את התאים ב- PBS עם סידן כלורי ומגנזיום כלורי בריכוז של 40 מיליון תאים למיליליטר.
עבור הרכבת קומפלקס sgRNA Cas9 ribonucleoprotein, הוסף 2.5 מיקרוליטר של sgRNA למיקרוליטר אחד של Cas9 מדולל בצינורות PCR מעוקרים וחלק את sgRNA לאט עם ערבוב במשך כ -15 שניות כדי למנוע משקעים. יש לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר היווצרות קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין. כדי להעביר את קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין על ידי אלקטרופורציה, הכינו את קצה האלקטרופורציה על ידי לחיצה על הבוכנה כדי להאריך את הגבעול.
לאחר מכן הכנס את הגבעול לקצה. להשהות מחדש את התאים על ידי pipeting למעלה ולמטה. טען את קצה האלקטרופורציה עם התאים ומשוך את מלוא קיבולת נפח 10 מיקרוליטר של הקצה.
החל מ sgRNA ביקורת שלילי, להעביר 10 מיקרוליטר של תאים בקצה אלקטרופורציה לצינור הדגימה המכיל 3.5 מיקרוליטר של ריבונוקלאו פרוטאין. פיפטה למעלה ולמטה שלוש פעמים כדי לערבב היטב, ולשאוב 10 מיקרוליטר של התערובת בחזרה לקצה. הכנס את הקצה לתחנת האלקטרופורציה, הורד אותו לתוך המאגר ולחץ על Start בתצוגת מסך המגע.
לאחר השלמתה, התצוגה תציין דופק מוצלח. מוציאים את פיפטה מהמכשיר ומניחים את התאים בבאר יבשה של צלחת 12 באר לא מצופה. שטפו את הקצה על ידי פיטינג למעלה ולמטה פעמיים ב-15 מיליליטר PBS עם סידן כלורי ומגנזיום כלורי.
הניחו בצד את הפיפטה כשהקצה עדיין מחובר. מיד להוסיף מיליליטר אחד של מדיום ללא אנטיביוטיקה aliquoted קודם לכן לתאים בעדינות לנער את הצלחת כדי לערבב. כרומטוגרמה מייצגת של ריצוף סנגר של מוקד רוזה 26 ממקרופאגים שמקורם במח עצם שהתחשמלו עם sgRNA מבוקר שאינו ממוקד, Cas9 ריבונוקלאו פרוטאין, Rosa 26 sgRNA ספציפי, וגנים Src ו-Cblb במקרופאגים הערוכים, מוצגים כאן.
ניתוח הגנים הממוקדים על ידי ריצוף PCR וסנגר מראה נוקלאוטידים מרובים בכל מיקום במורד הזרם של אתר המחשוף Cas9. תוצאות אלה מאמתות את השגת יעילות עריכה גבוהה עבור גנים ממוקדים מרובים.
