עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH 5R01AI144149. הדמויות הסכמטיות נוצרו באמצעות BioRender.

מדריך לשיבוש גנים מדויק במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם

<ol>
	<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets.">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+biology+in+development,+homeostasis,+and+disease.">Macrophage biology in development, homeostasis, and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li><li>Paddison, P. J., Caudy, A. A., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+suppression+of+gene+expression+by+RNAi+in+mammalian+cells.">Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (3), 1443-1448 (2002).</li><li>Laugel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+isogenic+cells+deficient+for+MR1+with+a+CRISPR/Cas9+lentiviral+system:+Tools+to+study+microbial+antigen+processing+and+presentation+to+human+MR1-restricted+T+cells.">Engineering of isogenic cells deficient for MR1 with a CRISPR/Cas9 lentiviral system: Tools to study microbial antigen processing and presentation to human MR1-restricted T cells.</a> The Journal of Immunology. 197 (3), 971-982 (2016).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+macrophages+and+J774+cells+respond+differently+to+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis.">Primary macrophages and J774 cells respond differently to infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> Scientific Reports. 7, 42225 (2017).</li><li>Roberts, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9++conditionally-immortalized+macrophages+as+a+tool+for+bacterial+pathogenesis+and+beyond.">Cas9+ conditionally-immortalized macrophages as a tool for bacterial pathogenesis and beyond.</a> eLife. 8, e45957 (2019).</li><li>Oberdoerffer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+RNA+interference+in+the+mouse+hematopoietic+system+varies+between+cell+types+and+developmental+stages.">Efficiency of RNA interference in the mouse hematopoietic system varies between cell types and developmental stages.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (10), 3896-3905 (2005).</li><li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YTHDF2+orchestrates+tumor-associated+macrophage+reprogramming+and+controls+antitumor+immunity+through+CD8++T+cells.">YTHDF2 orchestrates tumor-associated macrophage reprogramming and controls antitumor immunity through CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 24 (2), 255-266 (2023).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Cho, S. W., Kim, S., Kim, J. M., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+engineering+in+human+cells+with+the+Cas9+RNA-guided+endonuclease.">Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 230-232 (2013).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells.">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, e00471 (2013).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li><li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition.">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), e168 (2014).</li><li>Craft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+primary+murine+bone+marrow-derived+macrophages.">CRISPR-Cas9-mediated genome editing in primary murine bone marrow-derived macrophages.</a> University of California, Davis. , (2022).</li><li>Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Kr&#246;nke, M., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+transfection+of+primary+macrophages+with+in+vitro+transcribed+mRNA.">Highly efficient transfection of primary macrophages with in vitro transcribed mRNA.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60143 (2019).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+delivery+of+Cas9+protein/gRNA+complexes+using+lipofectamine+CRISPRMAX.">Improved delivery of Cas9 protein/gRNA complexes using lipofectamine CRISPRMAX.</a> Biotechnology Letters. 38 (6), 919-929 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

עריכת גנום באמצעות קומפלקסים חשמליים של Cas9-sgRNA מאפשרת שיבוש יעיל של תפקוד הגנים ב-BMDM. יעילות העריכה משתנה בהתאם לרצף היעד ולגן היעד. בדרך כלל, ארבעה עד חמישה sgRNA נבדקים בדרך כלל כדי לזהות אחד פעיל מאוד. לאתרים מסוימים יעילות עריכה נמוכה יותר, ככל הנראה בשל מבנה הכרומטין. במקרים אלה, ניתן לבצע ...

מקרופאגים הם תאי חיסון מולדים הממלאים תפקידים קריטיים בתיקון רקמות ובמערכת החיסון 1,2. לקווי תאי מקרופאגים אימורטליים, כגון תאי עכבר RAW 264.7 או תאי THP-1 אנושיים, יש מספר מאפיינים מועילים, כולל צמיחה חזקה וקלות של שיבוש גנים על ידי העברת וקטורים להפרעות RNA או CRISPR/Cas9 3,4. עם זאת, טרנספורמציה אונקוגנית משנה באופן דרמטי את הפיזיולוגיה שלהם, מה שמביא להפעלה חריגה של מסלולים מסוימים ותגובות מושתקות של אחרים 5,6. מקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם (BMDMs) דומים יותר לפיזיולוגיה של מקרופאגים in vivo, אך עדיין מאתגרים למניפולציה גנטית בשל היעילות הנמוכה הן של טרנספקציית פלסמיד והן של התמרה נגיפית בתאי חיסון ראשוניים אלה 7,8. לפיכך, יש צורך בשיטות יעילות יותר לשיבוש תפקוד הגנים.
עריכת גנום CRISPR/Cas9 היא כלי רב עוצמה למניפולציה גנטית במגוון מערכות ביולוגיות, כולל תאי יונקים 9,10,11,12. חלבון Streptococcus pyogenes Cas9 קוטע ביעילות ובאופן ספציפי DNA דו-גדילי כאשר הוא מורכב עם RNA מנחה ספציפי לרצף. תיקון DNA באמצעות חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ) של הדנ"א השסוע גורם להחדרות או מחיקות קטנות (indels) היוצרות מוטציות frameshift. במחקרים מוקדמים, Cas9 ו-sgRNA הועברו באמצעות וקטורים פלסמידים או לנטי-ויראליים, שהם שיטות העברה יעילות עבור קווי תאים רבים 9,10. עם זאת, תאים ראשוניים, ובמיוחד תאים חיסוניים ראשוניים, הם לעתים קרובות עקשנים לשיטות אלה בשל היעילות הנמוכה של העברת וקטורים על ידי טרנספקציה או טרנסדוקציה. לאחר מכן, פותחו שיטות ליצירת קומפלקסים sgRNA-Cas9 במבחנה ולהעברתם באמצעות אלקטרופורציה, ושיטות אלה השיגו יעילות גבוהה במגוון סוגי תאים13,14. התוצאות הצביעו על האפשרות להשתמש בגישה זו לביצוע עריכת גנום במקרופאגים ראשוניים.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול לשימוש בקומפלקסים של ריבונוקלאו פרוטאין sgRNA-Cas9 (RNPs) לביצוע עריכת גנום ב- BMDM ראשוניים. הוא מכיל צעדים להפחתת ההפעלה של חיישני החיסון הנמצאים בתאי חיסון ראשוניים ומביא לעריכה של עד 95% באתרים ממוקדים עם רעילות מינימלית. פרוטוקול זה כולל גם זרימות עבודה להערכת יעילות העריכה באמצעות תגובת שרשרת שגרתית של פולימראז (PCR) וריצוף Sanger, ולאחר מכן ניתוח סיליקו על ידי Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, כלי תוכנה מקוון מאומת היטב.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3T3-MCSF Cell Line</td>
			<td>Gift from Russell Vance</td>
			<td>not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R Cas9 Electroporation Enhancer</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1075915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP Reagent Beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf intestinal alkaline phosphatase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0525S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS +Ca/Mg (0.9mM CaCl2 and 0.5mM MgCl2)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS -Ca/Mg</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0293S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herculase DNA polymerase &#38; buffer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>E2040S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind conical tubes 15 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30122216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LoBind Eppendorf tubes 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer r2.1</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6002S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK5000, MPP100, MPS100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 uL Tips</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MPK1025 or MPK1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS + 1mM EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE02017F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCutSmart Buffer for ExoI</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B6004S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribolock</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EO0384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B0363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS</td>
			<td>University of California Macro Lab</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>Available to non-UC investigators through&#160; https://qb3.berkeley.edu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. pyogenes Cas9-NLS, modified 3rd Generation</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAP</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0371S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-efficiency gene disruption in primary bone marrow-derived macrophages using electroporated cas9-sgrna complexes

מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDM) מעכברים הם כלי מפתח לחקר הביולוגיה המורכבת של מקרופאגים ברקמות. כתאים ראשוניים, הם מדגימים את הפיזיולוגיה של מקרופאגים in vivo באופן הדוק יותר מאשר שורות תאי מקרופאגים אימורטליים, וניתן לגזור אותם מעכברים שכבר נושאים שינויים גנטיים מוגדרים. עם זאת, שיבוש תפקוד הגנים ב- BMDM נותר מאתגר מבחינה טכנית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לעריכת גנום CRISPR/Cas9 יעילה ב- BMDM, המאפשר החדרה של החדרות ומחיקות קטנות (indels) הגורמות למוטציות frameshift המשבשות את תפקוד הגנים. הפרוטוקול מתאר כיצד לסנתז RNA מדריך יחיד (sgRNA-Cas9) וליצור קומפלקסים מטוהרים של ריבונוקלאו פרוטאין sgRNA-Cas9 (RNPs) שניתן להעביר באמצעות אלקטרופורציה. הוא גם מספק שיטה יעילה לניטור יעילות העריכה באמצעות ריצוף Sanger שגרתי ותוכנית ניתוח מקוונת זמינה באופן חופשי. הפרוטוקול יכול להתבצע בתוך שבוע ואינו דורש בניית פלסמיד; התוצאה היא בדרך כלל יעילות עריכה של 85% עד 95%.

Macrophages are innate immune cells that play critical roles in tissue repair and immunity1,2. Immortalized macrophage cell lines, such as mouse RAW 264.7 cells or human THP-1 cells, have several beneficial characteristics, including robust growth and ease of gene disruption by delivering vectors for RNA interference or CRISPR/Cas93,4. However, oncogenic transformation dramatically alters their physiology, which results in the aberrant activation of some pathways and muted responses of others5,6. Primary bone marrow-derived macrophages (BMDMs) more closely recapitulate in vivo macrophage physiology, but remain challenging to genetically manipulate due to the low efficiency of both plasmid transfection and viral transduction in these primary immune cells7,8. Thus, more efficient methods for disrupting gene function are needed.
CRISPR/Cas9 genome editing is a powerful tool for genetic manipulation across a range of biological systems, including mammalian cells9,10,11,12. The Streptococcus pyogenes Cas9 protein efficiently and specifically cleaves double-stranded DNA when complexed with a sequence-specific guide RNA. DNA repair through the non-homologous end joining (NHEJ) of the cleaved DNA results in small insertions or deletions (indels) that create frameshift mutations. In early studies, Cas9 and sgRNAs were delivered through plasmid or lentiviral vectors, which are effective delivery methods for many cell lines9,10. However, primary cells and, in particular, primary immune cells are often refractory to these methods due to the low efficiency of vector delivery by transfection or transduction. Subsequently, methods have been developed to generate sgRNA-Cas9 complexes in vitro and to deliver them via electroporation, and these methods have achieved high efficiency in a variety of cell types13,14. The results have suggested the possibility of using this approach to carry out genome editing in primary macrophages.
Here, we provide a protocol for using sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) to carry out genome editing in primary BMDMs. It contains steps to mitigate the activation of the immune sensors present in primary immune cells and results in up to 95% editing at targeted loci with minimal toxicity. This protocol also includes workflows to evaluate editing efficiency using routine polymerase chain reaction (PCR) and Sanger sequencing, followed by in silico analysis by Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)15, a well-validated online software tool.

Author Spotlight: עריכה יעילה של גנום CRISPR/Cas9 במקרופאגים שמקורם במח עצם לשיבוש גנים מדויק

שיבוש גנים ביעילות גבוהה במקרופאגים ראשוניים שמקורם במח עצם באמצעות קומפלקסים מחושמלים של Cas9-sgRNA

תבנית IVT היא מוצר PCR של 127 bp (איור 1B). תוצר ה-IVT באורך מלא הוא רנ"א של 98 ננוגרם, אשר נודד באופן דומה למקטע דנ"א דו-גדילי של 70 bp (איור 1C).
לאחר אלקטרופורציה, התאים צריכים להיות >90% קיימא, עם ספירת תאים כוללת של >70% ממספר התא ההתחלתי. מאגר התאים המוטנטיים ה...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Efficient CRISPR/Cas9 Genome Editing in Bone Marrow-Derived Macrophages for Precise Gene Disruption at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר את הליך עריכת הגנום במקרופאגים שמקורם במח עצם עכבר באמצעות קומפלקסים של Cas9-sgRNA ribonucleoprotein המורכבים במבחנה ומועברים על ידי אלקטרופורציה.

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

המעבדה שלנו חוקרת את האינטראקציה בין מיקובקטריום, שחפת ומערכת החיסון של המאכסן, תוך התמקדות באינטראקציה הראשונית בין החיידק למקרופאגים. יש מגוון של טכניקות שיבוש גנים המשמשות במקרופאגים, כולל טכנולוגיות RNAi וטכנולוגיות CRISPR. אחד האתגרים הגדולים הוא היעילות הנמוכה של שיבוש גנים במקרופאגים.פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה גנטית מהירה ויעילה של מקרופאגים ראשוניים ללא צורך בשיבוט ובניית פלסמיד. שיטות אלה צריכות להיות ישימות באופן נרחב באימונולוגיה, ולאפשר לחוקרים לשבש גנים במקרופאגים ראשוניים עבור מגוון רחב של מחקרים.

high-efficiency-gene-disruption-primary-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

1.2K Views.  University of California, Davis. המעבדה שלנו חוקרת את האינטראקציה בין מיקובקטריום, שחפת ומערכת החיסון של המאכסן, תוך התמקדות באינטראקציה הראשונית בין החיידק למקרופאגים. יש מגוון של טכניקות שיבוש גנים המשמשות במקרופאגים, כולל טכנולוגיות RNAi וטכנולוגיות CRISPR. אחד האתגרים הגדולים הוא היעילות הנמוכה של שיבוש ...

Video: Author Spotlight: עריכה יעילה של גנום CRISPR/Cas9 במקרופאגים שמקורם במח עצם לשיבוש גנים מדויק

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.