כדי להתחיל, לקחת Pseudomonas aeruginosa תרבויות גדל במשך 24 שעות. לאחר מכן הגדר את צפיפותו האופטית על 600 ננומטר ל -0.2 ובצע דילולים מתאימים באמצעות 0.8% מלוחים. בעזרת לולאת תיל סטרילית, פזרו את תרבית החיידקים על צלחת האגר CAS.
לדגור על צלחת אגר CAS ב 30 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. העבירו את התרבית ללוח מיקרוטיטר בעל 96 בארות ומדדו את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר. לאחר מכן, להעביר את התרביות לתוך צינורות צנטריפוגה.
צנטריפוגה את תרבית החיידקים ב 4650 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה מוציאה 100 מיקרוליטר של סופרנטנט נטול תאים, ומוסיפה אותו לבאר של צלחת 96 בארות. לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של צבע CAS לבאר.
מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום לפני הדגירה. לאחר הדגירה, בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ב-630 ננומטר וחשב את הכמות הכוללת של סידרופורים כיחידת סידרופור אחוזה. פיפטה 100 מיקרוליטר של supernatant ללא תאים לתוך צלחת microtiter 96 באר.
לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטר של חומצה tris-hydrochloric אליו. מדוד את הקריאה הספקטרופוטומטרית של התמיסה ב 405 ננומטר. עבור מיצוי pyochelin, הראשון, פיפטה 100 מיליליטר של תרביות גדל 48 שעות של Pseudomonas aeruginosa לתוך צינורות צנטריפוגה.
צנטריפוגה את התרביות ב 4650 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של חומצת לימון מולרית אחת supernatant. הוסף 50 מיליליטר של אתיל אצטט לתמיסה כדי לחלץ פיוכלין.
מסננים את השלב האורגני עם מגנזיום גופרתי דרך מסנן מזרק. לאחר מכן אחסנו את הפאזה האורגנית במינוס 20 מעלות צלזיוס. לבסוף, בצע קריאות ספקטרופוטומטריות במהירות של 320 ננומטר.
שלושת המבודדים הקליניים וזן הייחוס, PAO1, פיתחו הילה כתומה ברורה כאשר גדלו על אגר CAS, המעידה על ייצור סידרופור. הבדלים משמעותיים נצפו בין הייצור הכולל של סידרופור של מבודד J3 לבין PAO1. ניתוחים ספקטרופוטומטריים של תמצית הפיוברדין הציגו שיא מאשר של 380 ננומטר.
בעוד שכל המבודדים היו חיוביים לייצור פיוברדין, MR1 ו-J3 הראו תפוקה נמוכה יותר ביחס לזן הייחוס. נוכחותו של פיוכלין אושרה על ידי שיא של 320 ננומטר. כל שלושת המבודדים הקליניים הפיקו נפחים גבוהים משמעותית בהשוואה ל-PAO1.
