המחברים מודים על מימון DBT - תוכנית הוראת ביוטכנולוגיה, DBT - תוכנית BUILDER ו- FIST. מר תודה מלגת שו"ד. מלגת תודה של HP שהתקבלה מ-CSIR.

כל המבודדים החיידקיים של P. aeruginosa התקבלו ממעבדות מיקרוביולוגיה רפואית מוואדודרה וג'איפור, הודו. כל המבודדים הקליניים שנבחרו טופלו בארון הבטיחות הביולוגית (BSL2) וננקטה זהירות מרבית בעת הטיפול במבודדים חיידקיים במהלך הניסויים. הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים/פתרונות מופיעים בטבלת החומרים.
1. הכנת צבע כרום אזורול סולפונט (CAS) ומדיה אגר
<ol><li>הכן צבע CAS (100 מ"ל) עם הרכב הבא:<ol><li>יש להמיס 60 מ"ג CAS ב-50 מ"ל מים מזוקקים (תמיסה 1).</li>
		<li>יש להמיס 2.7 מ"ג של FeCl3·6H2O ב-10 מ"ל של 10 mM HCl (תמיסה 2).</li>
		<li>להמיס 73 מ"ג של Cetrimonium bromide (HDTMA) ב 40 מ"ל של מים מזוקקים (תמיסה 3).</li>
		<li>ערבב בזהירות את פתרון 1, פתרון 2 ופתרון 3. אחסנו אותו בבקבוק זכוכית.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו אגר CAS לפי השלבים הבאים:<ol><li>הוסף 100 מ"ל של תמיסת מלח MM9 ל 750 מ"ל של מים מזוקקים.</li>
		<li>ממיסים 32.24 גרם של חומצה חופשית פיפרזין-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES).</li>
		<li>מוסיפים 15 גרם אגר אגר. Autoclave ולאפשר לו להתקרר.</li>
		<li>הוסף 30 מ"ל של תמיסת חומצות קאמינו סטריליות ו -10 מ"ל של תמיסת גלוקוז סטרילית 20% לתערובת.</li>
		<li>מוסיפים 100 מ"ל צבע CAS, מערבבים ויוצקים בתנאים אספטיים. הערה: הכנת מדיה MM9, תמיסת חומצות קאמינו ו- 8-הידרוקסיקינולין מסופקים בקובץ משלים 1. מאגר PIPES רגיש ל- pH. זה לא יתמוסס עד pH 5.6 מושגת. ודא כי ה- pH מנוטר כל הזמן מכיוון שכאשר PIPES מתחיל להתמוסס במים, זה יוריד עוד יותר את ה- pH. לחלץ חומצת קאמינו באותו נפח של 3% 8-hydroxyquinoline מומס כלורופורם. השאירו את התמיסה הבלתי ניתנת להפרכה על 4°C למשך כ-20 דקות ואספו בזהירות את השלב העליון של התמיסה מבלי להפריע לשלב התחתון.</li>
	</ol></li>
</ol>2. ניתוח איכותי של ייצור סידרופורים
<ol><li>הגדר את OD600 ננומטר ל- 0.2 עבור תרביות שגדלו ב- 24 שעות של P. aeruginosa.</li>
	<li>בעזרת לולאת תיל סטרילית, פזרו את תרבית החיידקים על צלחת אגר CAS.</li>
	<li>לדגור ב 30 ° C במשך 24 שעות. הערה: ניתן להשתמש במי פפטון או במי מלח רגילים של 0.8% כדי לדלל את תרבית החיידקים. אם לא נצפתה צמיחת חיידקים במשך 24 שעות, דגרו על לוחות CAS במשך 48 עד 72 שעות.</li>
</ol>3. אומדן כמותי של סך הסידרופורים
<ol><li>יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגדלו ב-24 שעות במצע המים של פפטון לאחר התאמת OD600 ננומטר ל-0.25, ולדגור ב-30°C למשך 48 שעות.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, צנטריפוגו את תרבית החיידקים ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר הצנטריפוגה, הוסף 100 μL של supernatant ללא תאים לצלחת microtiter 96 באר ולהוסיף 100 μL של צבע CAS אליו.</li>
	<li>מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום ודגרים בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ב- 630 ננומטר.</li>
	<li>חשב את התוצאות המתקבלות לכימות של סך כל הסידרופורים כיחידת סיידרופור אחוז (PSU). הערה: ניתן לחשב ספק כוח כ: [(Ar - As)/Ar] x 100 כאשר,A r = ספיגה של הייחוס ב 630 ננומטר, As = ספיגה של supernatant ללא תאים של הדגימה. לשם השוואה, יש להוסיף צבע CAS למצע מי פפטון לא מחוסנים. מלאו את כל כלי הזכוכית, כגון מבחנות, צלוחיות וכו', ב-6 M HCl למשך שעתיים ושטפו אותם פעמיים במים מזוקקים כדי להסיר כל זכר ברזל עליהם.</li>
</ol>4. הערכה כמותית של pyoverdine
<ol><li>יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגודלו ב-24 שעות במדיית המים של פפטון לאחר התאמת OD600 ננומטר ל-0.25 ולדגור ב-30°C במשך 48 שעות.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, מדדו את OD600 ננומטר של צמיחת החיידקים לפני שתמשיכו הלאה.</li>
	<li>צנטריפוגה את תרבית החיידקים ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר הצנטריפוגה, הוסף 100 μL של supernatant ללא תאים לצלחת microtiter 96 באר ולהוסיף 100 μL של 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) אליו.</li>
	<li>בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ב- OD405 nm.</li>
</ol>5. מיצוי פיוכלין וספקטרופוטומטריה
<ol><li>יש לחסן מחדש תרביות של P. aeruginosa שגדלו ב-24 שעות במדיה של King's B (קובץ משלים 1) לאחר התאמת OD600 ננומטר ל-0.25 ולדגור ב-30°C למשך 24 שעות.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, קח 100 מ"ל של תרבית וצנטריפוגה ב 4650 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לאחר הצנטריפוגה, להוסיף 5 מ"ל של 1 M חומצת לימון supernatant. לחלץ פעמיים עם 50 מ"ל של אתיל אצטט.</li>
	<li>מסננים את השלב האורגני עם מגנזיום גופרתי דרך מסנן מזרק. אחסנו את הפאזה האורגנית המסוננת בטמפרטורה של -20°C.</li>
	<li>בצע קריאות ספקטרופוטומטריות ברזולוציה של 320 ננומטר. הערה: מכיוון שפיוכלין היא תרכובת מאוד לא יציבה בטמפרטורת החדר, בצע את תהליך המיצוי על קרח. השתמש מזרק סטרילי 50 מ"ל להפרדת המסנן. מניחים כותנה בקצה המזרק ומוסיפים עליו 1 גרם מגנזיום גופרתי. מקבעים מסנן מזרק סטרילי בקצה המזרק ואוספים את התסנין בצינור סטרילי.</li>
</ol>

הערכה של ייצור סידרופור מבודד Pseudomonas aeruginosa

<ol>
	<li>Wang, J., Pontopolous, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+iron+cellulatar+metabolism.">Regulation of iron cellulatar metabolism.</a> Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).</li><li>Schalk, I., Perraud, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+and+its+multiple+strategies+to+access+iron.">Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron.</a> Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).</li><li>Ghssein, G., Ezzeddine, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+Pseudomonas+aeruginosa+metallophores:+Pyoverdine,+pyochelin+and+pseudopaline.">A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline.</a> Biology. 11 (12), 1711 (2022).</li><li>Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+iron+homeostasis+in+pseudomonas+aeruginosa+and+emerging+therapeutics+directed+to+disrupt+this+vital+process.">Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process.</a> Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).</li><li>Cornelis, P., Dingemans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+adapts+its+iron+uptake+strategies+in+function+of+the+type+of+infections.">Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).</li><li>Lin, J., Cheng, J., Shen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pseudomonas+quinolone+signal+(pqs):+Not+just+for+quorum+sensing+anymore.">The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).</li><li>Sass, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermicrobial+interaction:+Aspergillus+fumigatus+siderophores+protect+against+competition+by+pseudomonas+aeruginosa.">Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).</li><li>Dao, K. -. H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+production+by+pseudomonas+aeruginosa+exposed+to+metals+or+an+oxidative+stress+agent.">Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent.</a> Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).</li><li>Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyoverdine+siderophores:+From+biogenesis+to+biosignificance.">Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance.</a> Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).</li><li>Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+of+the+nonribosomal+peptide+synthetase+pvdd+from+pseudomonas+aeruginosa.">Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).</li><li>Geum-Jae-Jeong, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+aeruginosa+virulence+attenuation+by+inhibiting+siderophore+functions.">Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).</li><li>Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switching+between+apparently+redundant+iron-uptake+mechanisms+benefits+bacteria+in+changeable+environments.">Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments.</a> Biological Sciences. 280 (1764), 20131055 (2013).</li><li>Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isochorismate+synthase+(pcha),+the+first+and+rate-limiting+enzyme+in+salicylate+biosynthesis+of+pseudomonas+aeruginosa.">Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).</li><li>Schwyn, B., Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+chemical+assay+for+the+detection+and+determination+of+siderophores.">Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores.</a> Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).</li><li>Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+blue+agar+cas+assay+for+siderophore+detection.">Use of blue agar cas assay for siderophore detection.</a> Journal of Microbiology &amp; Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).</li><li>Arora, N. K., Verma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+microplate+method+for+rapid+and+efficient+estimation+of+siderophore+produced+by+bacteria.">Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria.</a> 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).</li><li>Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+accurate+microplate+method+(biolog+mt2)+for+detection+of+fusarium+fungicides+resistance/sensitivity.">Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).</li><li>Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+and+biology+of+pyoverdines,+pseudomonas+primary+siderophores.">Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).</li><li>Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+metal+specificity+of+the+pseudomonas+aeruginosa+pyoverdine-iron+uptake+pathway.">New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway.</a> Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).</li><li>Brandel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+siderophore+of+pseudomonas+aeruginosa:+Physicochemical+characterization+of+the+iron(iii),+copper+(ii)+and+zinc+(ii)+complexes.">a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes.</a> Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).</li><li>Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudomonas+methods+and+protocols.">Pseudomonas methods and protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).</li><li>Cunrath, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogen+pseudomonas+aeruginosa+optimizes+the+production+of+the+siderophore+pyochelin+upon+environmental+challenges.">The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges.</a> Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).</li><li>Ji, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+and+sensitive+LC/MS/MS+method+for+quantification+of+pyochelin+in+human+sputum+samples+from+cystic+fibrosis+patients.">A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients.</a> Biomarkers &amp; Applications. 4 (1), 135 (2019).</li><li>Visaggio, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+luminescent+biosensor+for+the+microvolumetric+detection+of+the+pseudomonas+aeruginosa+siderophore+pyochelin.">A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).</li><li>Miethke, M., Marahiel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Siderophore-bases+iron+acquisition+and+pathogen+control.">Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).</li><li>Il, J. M. R., Lin, Y. -. M., Lu, Y., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+and+syntheses+of+siderophores,+microbial+iron+chelators,+and+analogs+as+potential+drug+delivery+agents.">Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents.</a> Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לכמת את סך כל הסידרופורים ושני סידרופורים שונים של P. aeruginosa, כלומר פיוברדין ופיוצ'לין, מהסופרנטנט נטול התאים של החיידקים. במבחן צלחות אגר CAS, צבע CAS ויוני Fe3+ יוצרים קומפלקס. כאשר חיידקים מייצרים סידרופורים, הם מרווים יוני Fe3+ מקומפלקס CAS-Fe3+, מה ש...

אורגניזמים זקוקים לברזל כדי לבצע פונקציות חיוניות שונות, כגון הובלת אלקטרונים ושכפול דנ"א1. Pseudomonas aeruginosa, פתוגן אופורטוניסטי גראם-שלילי, ידוע כבעל מגוון גורמים אלימים לביסוס זיהום בפונדקאי, ביניהם מנגנון אחד הוא היווצרות סידרופור2. בתנאים של דלדול ברזל, P. aeruginosa משחרר מולקולות מיוחדות שנקראות סידרופורים, אשר מרווה ברזל מהסביבה. Siderophores chelate ברזל extracellularly, ואת קומפלקס ferric-siderophore וכתוצאה מכך מועבר באופן פעיל בחזרה לתא3.
P. aeruginosa ידוע לייצר שני siderophores, pyoverdine ו pyochelin. ידוע שפיוברדין הוא בעל זיקה גבוהה יותר לתצבית ברזל (1:1), ואילו פיוכלין ידוע כבעל זיקה פחותה לתצבית ברזל (2:1)4. פיוכלין נקרא גם סידרופור משני מכיוון שיש לו זיקה נמוכה יותר לתצבית ברזל5. הייצור והרגולציה של סידרופורים נשלטים באופן פעיל על ידי מערכות חישת מניין (QS) ב- P. aeruginosa6.
מלבד מרווה ברזל, סידרופורים מעורבים גם בוויסות גורמי אלימות וממלאים תפקיד פעיל בהיווצרות ביופילם7. סידרופורים ממלאים תפקידים חיוניים נוספים, כולל מעורבות באיתות תאי, הגנה מפני עקה חמצונית והקלה על אינטראקציות בין קהילות מיקרוביאליות8. סידרופורים מסווגים בדרך כלל על בסיס הקבוצות הפונקציונליות הספציפיות שדרכן הם מכלכים ברזל. שלושת הליגנדים הדו-שינטיים העיקריים בסיווג זה הם קטכולאט, הידרוקסאמט ו-α-הידרוקסי-קרבוקסילט3. Pyoverdines הם סימני היכר של מיני Pseudomonas פלואורסצנטיים כגון P. aeruginosa ו P. fluorescens5. הם מורכבים מכרומופור פלואורסצנטי ירוק מעורב המחובר לאוליגופפטיד המכיל 6-12 חומצות אמינו. מספר סינתזות פפטידיות לא ריבוזומליות (NRPs) מעורבות בסינתזה שלהן9. ארבעה גנים המעורבים בייצור ובוויסות של פיוברדין הם pvdL, pvdI, pvdJ ו-pvdD10. פיברדין אחראי גם לזיהום ולאלימות ביונקים11. P. aeruginosa ידוע לייצר pyochelin בתנאים מתונים הגבלת ברזל, בעוד pyoverdine מיוצר בסביבות חמורות הגבלת ברזל12. שני אופרונים המעורבים בייצור פיוכלין הם pchDCBA ו-pchEFGHI13. יצוין כי בנוכחות pyocyanin, pyochelin (catecholate) גורם נזק חמצוני ודלקת ומייצר רדיקלים hydroxyl, אשר מזיקים לרקמות המארח11.
בדיקת Chrome Azurol Sulfonate (CAS) מאומצת באופן נרחב בשל מקיפותה, רגישותה הגבוהה ונוחותה הרבה יותר בהשוואה לבדיקות מיקרוביולוגיות, אשר, למרות רגישותן, יכולות להיות ספציפיות מדי14. בדיקת CAS יכולה להתבצע על משטחי אגר או בתמיסה. הוא מסתמך על שינוי הצבע המתרחש כאשר יון הברזל עובר מהקומפלקס הכחול העז שלו לכתום. בדיקת CAS colorimetric מכמתת את דלדול הברזל מקומפלקס טרינרי Fe-CAS-surfactant. קומפלקס מסוים זה, המורכב ממתכת, צבע אורגני וחומרים פעילי שטח, הוא בעל צבע כחול ומציג שיא ספיגה של 630 ננומטר.
דו"ח זה מציג שיטה לזיהוי איכותי של ייצור סידרופורים, שבה ניתן לזהות ייצור של סידרופורים על צלחת אגר. שיטה להערכה כמותית של סך ייצור הסידרופורים בצלחת מיקרוטיטר וזיהוי וניתוח כמותי של שני סידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין, מ- P. aeruginosa, מסופקת גם כן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar Agar, Type I</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>GRM666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-Hydroxyquinoline</td>
			<td>Loba Chemie</td>
			<td>4151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casamino Acid</td>
			<td>SRL Chemicals</td>
			<td>68806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>RM4867-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1070242521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chrome azurol sulfonate</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>RM336-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose monohydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric chloride hexahydrate</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>GRM6353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Flasks</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>5100021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Test-tubes</td>
			<td>Borosil</td>
			<td>9820U05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SDFCL</td>
			<td>20125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>King&#39;s medium B base</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>M1544-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M9 Minimal Medium Salts</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>G013-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate&#160;</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>10034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiskanGO UV Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51119200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Type I, Bacteriological</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>RM667-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES free acid</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>190257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1048731000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteose peptone</td>
			<td>HIMEDIA</td>
			<td>RM005-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>2072310058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma Laborzentrifuge</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3-18K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Qualigens</td>
			<td>15915</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

qualitative and quantitative analysis of siderophore production from pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) ידוע בייצור מגוון רחב של גורמי אלימות כדי לבסס זיהומים בפונדקאי. מנגנון אחד כזה הוא ניקוי ברזל באמצעות ייצור סידרופור. P. aeruginosa מייצר שני סידרופורים שונים: פיוכלין, שיש לו זיקה נמוכה יותר לתצבית ברזל, ופיוברדין, שיש לו זיקה גבוהה יותר לתצבית ברזל. דו"ח זה מדגים כי ניתן לכמת פיוברדין ישירות מסופרנאטנטים חיידקיים, בעוד שפיוכלין צריך להיות מופק מסופרנאטנטים לפני הכימות.
השיטה העיקרית לניתוח איכותי של ייצור סידרופור היא בדיקת צלחת אגר כרום אזורול סולפונט (CAS). בבדיקה זו, שחרור צבע CAS מקומפלקס Fe3+-Dye מוביל לשינוי צבע מכחול לכתום, מה שמצביע על ייצור סידרופור. לצורך כימות הסידרופורים הכולל, סופרנאטנטים חיידקיים עורבבו בפרופורציות שוות עם צבע CAS בלוח מיקרוטיטר, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי ב-630 ננומטר. פיוברדין כומת ישירות מהסופרנאטנט החיידקי על ידי ערבובו בפרופורציות שוות עם 50 מילימטר Tris-HCl, ולאחר מכן ניתוח ספקטרופוטומטרי. שיא של 380 ננומטר אישר את נוכחותו של pyoverdine. באשר לפיוכלין, כימות ישיר מהסופרנאטנט החיידקי לא היה אפשרי, ולכן היה צורך לחלץ אותו תחילה. ניתוח ספקטרופוטומטרי שנערך לאחר מכן גילה נוכחות של פיוכלין, עם שיא של 313 ננומטר.

Organisms require iron to perform various vital functions, such as electron transport and DNA replication1. Pseudomonas aeruginosa, a Gram-negative opportunistic pathogen, is known to possess a variety of virulence factors to establish infection in the host, among which one mechanism is siderophore formation2. During iron-depleting conditions, P. aeruginosa releases specialized molecules called siderophores, which quench iron from the surrounding environment. Siderophores chelate iron extracellularly, and the resulting ferric-siderophore complex is actively transported back to the cell3.
P. aeruginosa is known to produce two siderophores, pyoverdine and pyochelin. Pyoverdine is known to have a higher iron chelating affinity (1:1), whereas pyochelin is known to have a lesser iron chelating affinity (2:1)4. Pyochelin is also called a secondary siderophore because it has a lower iron chelating affinity5. The production and regulation of siderophores are actively controlled by Quorum Sensing (QS) systems in P. aeruginosa6.
Besides iron quenching, siderophores are also involved in regulating virulence factors and play an active role in biofilm formation7. Siderophores serve additional crucial roles, including involvement in cell signaling, defense against oxidative stress, and facilitation of interactions between microbial communities8. Siderophores are typically categorized based on the specific functional groups through which they chelate iron. The three primary bidentate ligands in this classification are catecholate, hydroxamate, and &#945;-hydroxycarboxylate3. Pyoverdines are hallmarks of fluorescent Pseudomonas species such as P. aeruginosa and P. fluorescens5. They consist of a mixed green fluorescent chromophore coupled to an oligopeptide containing 6-12 amino acids. Several non-ribosomal peptide synthetases (NRPs) are involved in their synthesis9. Four genes involved in pyoverdine production and regulation are pvdL, pvdI, pvdJ, and pvdD10. Pyoverdine is also responsible for infection and virulence in mammals11. P. aeruginosa is noted to produce pyochelin in moderate iron-limiting conditions, while pyoverdine is produced during severe iron-limiting environments12. Two operons involved in pyochelin production are pchDCBA and pchEFGHI13. It is noted that in the presence of pyocyanin, pyochelin (catecholate) induces oxidative damage and inflammation and generates hydroxyl radicals, which are harmful to host tissues11.
The Chrome Azurol Sulfonate (CAS) assay is widely adopted due to its comprehensiveness, high sensitivity, and greater convenience compared to microbiological assays, which, although sensitive, can be overly specific14. The CAS assay can be conducted on agar surfaces or in a solution. It relies on the color change that occurs when the ferric ion transitions from its intense blue complex to orange. The CAS colorimetric assay quantifies the depletion of iron from a Fe-CAS-surfactant ternary complex. This particular complex, consisting of metal, organic dye, and surfactant, has a blue color and exhibits an absorption peak at 630 nm.
This report presents a method for the qualitative detection of siderophore production, where one can detect the production of siderophores on an agar plate. A method for the quantitative estimation of total siderophore production in a microtiter plate and the detection and quantitative analysis of two siderophores, pyoverdine and pyochelin, from P. aeruginosa, is also provided.

מחבר זרקור: כימות סידרופורים ופיוצ'לין לבקרת זיהומים 

ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa

Siderophores form complexes with iron and transport it into the cell during iron-limiting conditions. Siderophores are potent virulence factors which help in establishing severe infection in the host, and are known to play a role in regulating quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. Our research aims to quantitatively estimate siderophore production in Pseudomonas.Siderophores are extracellular molecules, so total siderophores, along with pyoverdine and pyochelin are quantified using cell-free supernatant. As pyochelin is not detected in small volume, extraction is performed from a large volume of cell-free supernatant. Recently, LCMS and biosensors have been developed for quantification of pyochelin.LCMS is a costly setup for small laboratories, whereas biosensors are capable of quantification of pyochelin only. This simple and illustrated protocol uses minimum laboratory reagents and instrumentation, and allows siderophore's estimation from cell-free supernatant using less time.

לפני כימות של סידרופורים ממבודדים קליניים, בוצע סינון איכותי לייצור סידרופורים כדי להבטיח ייצור סידרופורים. זיהוי איכותי של סידרופורים ממבודדים קליניים נצפה על ידי חיידקים מפוספסים על לוחות אגר CAS. שלושה מבודדים קליניים, כלומר MR1, TL7, J3, יחד עם PAO1 (זן הייחוס), נבחרו למחקר. כ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Siderophores and Pyochelin for Infection Control at JoVE.com

פרוטוקול זה מספק ניתוחים איכותיים וכמותיים של סך כל הסידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין מ - Pseudomonas aeruginosa.

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such ...

סידרופורים יוצרים קומפלקסים עם ברזל ומובילים אותו לתוך התא בתנאים מגבילי ברזל. סידרופורים הם גורמי אלימות רבי עוצמה המסייעים ביצירת זיהום חמור בפונדקאי, וידועים כממלאים תפקיד בוויסות חישת המניין בפסאודומונס ארוגינוזה. מטרת המחקר שלנו היא להעריך כמותית את ייצור הסידרופורים בפסאודומונס.סידרופורים הם מולקולות חוץ-תאיות, כך שסך כל הסידרופורים, יחד עם פיוברדין ופיוצ'לין מכומתים באמצעות סופרנטנט נטול תאים. מכיוון שפיוכלין אינו מזוהה בנפח קטן, החילוץ מתבצע מנפח גדול של סופרנטנט ללא תאים. לאחרונה, LCMS ו biosensors פותחו לכימות של pyochelin.LCMS הוא התקנה יקרה עבור מעבדות קטנות, בעוד biosensors מסוגלים לכמת של pyochelin בלבד. פרוטוקול פשוט ומאויר זה משתמש במינימום ריאגנטים ומכשור מעבדתיים, ומאפשר הערכה של סידרופור מסופרנאטנט נטול תאים תוך שימוש בפחות זמן.

qualitative-quantitative-analysis-siderophore-production-from

Research

JoVE Journal

Biology

Qualitative and Quantitative Analysis of Siderophore Production from Pseudomonas aeruginosa

2.8K Views.  The Maharaja Sayajirao University of Baroda. סידרופורים יוצרים קומפלקסים עם ברזל ומובילים אותו לתוך התא בתנאים מגבילי ברזל. סידרופורים הם גורמי אלימות רבי עוצמה המסייעים ביצירת זיהום חמור בפונדקאי, וידועים כממלאים תפקיד בוויסות חישת המניין בפסאודומונס ארוגינוזה. מטרת המחקר שלנו היא להעריך כמותית את ייצור הסידרופו?...

Video: מחבר זרקור: כימות סידרופורים ופיוצ'לין לבקרת זיהומים 

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is known for its production of a diverse range of virulence factors to establish infections in the host. One such mechanism is the scavenging of iron through siderophore production. P. aeruginosa produces two different siderophores: pyochelin, which has lower iron-chelating affinity, and pyoverdine, which has higher iron-chelating affinity. This report demonstrates that pyoverdine can be directly quantified from bacterial supernatants, while pyochelin needs to be extracted from supernatants before quantification.
The primary method for qualitatively analyzing siderophore production is the Chrome Azurol Sulfonate (CAS) agar plate assay. In this assay, the release of CAS dye from the Fe3+-Dye complex leads to a color change from blue to orange, indicating siderophore production. For the quantification of total siderophores, bacterial supernatants were mixed in equal proportions with CAS dye in a microtiter plate, followed by spectrophotometric analysis at 630 nm. Pyoverdine was directly quantified from the bacterial supernatant by mixing it in equal proportions with 50 mM Tris-HCl, followed by spectrophotometric analysis. A peak at 380 nm confirmed the presence of pyoverdine. As for Pyochelin, direct quantification from the bacterial supernatant was not possible, so it had to be extracted first. Subsequent spectrophotometric analysis revealed the presence of pyochelin, with a peak at 313 nm.

This protocol provides both qualitative and quantitative analyses of total siderophores, pyoverdine, and pyochelin from Pseudomonas aeruginosa.