Routine Passaging of Patient-Derived Gastric Organoids Through Fragmentation

לאחר שהאורגנואידים שמקורם בקיבה מוכנים לאריזה, יש להתחיל במעבר שגרתי של האורגנואידים. ראשית, הסר את המדיה מכל באר, המכילה את האורגנואידים, המוטבעים במטריצת קרום המרתף, שנעשתה בצלחת 24 בארות. לאחר מכן יש לפזר מיליליטר אחד של מדיית DMEM F12 מתקדמת קרה כקרח, ישירות על כיפת מטריצת קרום מרתף.

ממשיכים לשאוף ולפזר את המדיה, עד שכל שברי הכיפה מתנתקים מהצלחת. לאחר מכן להעביר הן את המדיה והן את מטריצת קרום המרתף המקוטעת מהבאר לבאר הבאה ולחזור על התהליך עבור כל הבארות המיועדות לאריזה. לאחר פירוק כיפת מטריצת קרום המרתף האחרונה, מוציאים את המדיה ואת התערובת לצינור 1.5 מיליליטר.

חבר קצה של 1000 מיקרוליטר לפיפטה P1000 ולאחר מכן הכנס קצה זה לקצה של 200 מיקרוליטר. באמצעות מערך פיפטה זה פיפטה נמרצת פיפטה תערובת מטריצת אורגנואידים למעלה ולמטה, בערך 25 פעמים כדי לפרק את האורגנואידים לחתיכות קטנות. צנטריפוגה את תערובת האורגנואידים המקוטעת, באמצעות צנטריפוגה שולחנית בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ב 2000 גרם.באמצעות פיפטה שואפים את המדיה ואת מטריצת קרום המרתף supernatant.

הוסף את הנפח המחושב של מטריצת קרום מרתף טרי לאורגנואידים הכדוריים בצינור. מזלפים בעדינות את תכולת הצינור למעלה ולמטה כדי לערבב. במהירות aliquot, 50 מיקרוליטר של תערובת מטריצת אורגנואיד לתוך בארות בודדות של צלחת 24 בארות.

מכסים את הצלחת מיד ובתנועה חלקה אחת, הופכים את הצלחת. הניחו את הצלחת ההפוכה באינקובטור תרבית רקמה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות כדי לאפשר למטריצת קרום המרתף להתפלמר. לבסוף, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיה אורגנואיד קיבה שחומם מראש לכל באר.

ביום ה-20 לאחר החניכה, אורגנואידים היו מוכנים למעבר, כפי שצוין על ידי גודל אורגנואיד גדול או פנים כהה. אורגנואידים שנותרו ללכת מעבר לנקודות אלה, החלו להתפרק לחד-שכבות דו-ממדיות. לאחר אריזה וזריעה מחדש של קיבה, הכיפות הכילו שברי אורגנואידים רבים שהתארגנו מחדש לאורגנואידים רבים יותר מהר מאוד.