לפני מעבר התא. מצפים צלחת בת שש בארות בתמיסת ציפוי קר ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שעה אחת, שואפים את תווך תאי הגזע מצלחת שש בארות המכילה תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, ומוסיפים מיליליטר אחד של DPBS נטול סידן מגנזיום לכל באר. לאחר השטיפה השנייה, מוסיפים 500 מיקרוליטר של תמיסת דיסוציאציה לכל באר ודגרים במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.
בינתיים, שאפו את תמיסת הציפוי מצלחת שש הבארות והוסיפו מיליליטר אחד של DPBS נטול סידן מגנזיום לכל באר. תחת מיקרוסקופ הפוך, התבוננו בתהליך הדיסוציאציה של התא. כאשר 80% עד 90% מהתאים נראו מעוגלים ודבוקים, שאפו את תמיסת הדיסוציאציה מהבארות של צלחת שש הקידוחים.
לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של תווך תאי גזע המכיל 10 מעכב סלע מיקרומולרי לצלחת שש בארות. הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים מנותק לתוך צינור. לאחר מכן, הוסף נפח שווה של כחול טריפאן.
מערבבים בעדינות וסופרים את התאים באמצעות המוציטומטר. לאחר ספירת תאים, הוסף שני מיליליטר של מדיום תאי גזע לכל באר המכיל 0.8 עד 1 כפול 10 לתאים 6 למיליליטר ו -10 מעכב סלע מיקרומולרי. הזז במהירות את הצלחת קדימה ואחורה, מצד לצד, שלוש פעמים.
מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני. הזיזו במהירות את הצלחת קדימה ואחורה ומצד לצד 10 פעמים לפני הדגירה למשך שעתיים. הפשירו גם את המדיום הבסיסי לימים אפס וארבע והשלימו על קרח.
יש לחמם שני מיליליטר בכל יום, מדיום אחד ולכבס בינוני אחד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן, שואפים את מדיום תאי הגזע מהבארות של צלחת שש בארות ומוסיפים שני מיליליטר של מדיום כביסה אחד. לאחר שאיפה בינוני כביסה אחד, מיד להוסיף שני מיליליטר של יום אחד בינוני לצד של הבאר.
לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות. ביום ה-12 לתהליך ההתמיינות, יש לטפל בצלחת בת שש בארות המכילה מיקרו-בארות בגודל 400 מיקרומטר עם שני מיליליטר של תמיסת שטיפה אנטי-היצמדות. תחת מיקרוסקופ הפוך, התבוננו בצלחת לאיתור בועות.
אם לא נצפו בועות, שאפו את תמיסת השטיפה נגד הדבקה והוסיפו מיד שני מיליליטר כביסה בינונית שתיים. לאחר מכן, לשאוף מדיום אב הלבלב ולהוסיף 0.5 מיליליטר של חיץ דיסוציאציה לכל באר. דוגרים על התאים בטמפרטורת החדר למשך שתיים עד חמש דקות.
כאשר רוב התאים מעוגלים ועדיין דבקים, שאפו את חיץ הדיסוציאציה והוסיפו מיד מיליליטר אחד של תווך אשכול חם לכל באר. בעזרת קצה פיפטה P1000, נתקו את התאים בעדינות, צנרת מעלה ומטה תוך שימוש לסירוגין בתנועה מעגלית ומעבר מלמעלה לתחתית הבאר כדי לנתק תאים באופן שווה ברחבי הבאר. מעבירים את תערובת התאים המנותקים לצינור חרוטי של 50 מיליליטר.
הוסף מיליליטר אחד של תווך הצביר לתוך צלחת שש בארות כדי לאסוף את כל התאים הנותרים. לאחר מכן, שאפו שטיפה בינונית שתיים מצלחת שש בארות מיקרווול והוסיפו השעיית תאים מנותקת. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
למחרת, באמצעות קצה פיפטה P1000, לאסוף לאט אשכולות מן צלחת שש בארות microwell לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. מוסיפים מיליליטר אחד של יום 13 בינוני כדי לאסוף את האשכולות הנותרים ולהעביר את האשכולות לתוך הצינור. אפשרו לתאים להתמקם באופן טבעי תחת כוח הכבידה לתחתית הצינור למשך חמש דקות.
שאפו בזהירות את הסופרנאטנט מהצינור מבלי להפריע לצברי התא. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של יום 13 בינוני לתוך הצינור. מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה, הימנעות משאיפה של אשכולות.
מעבירים את המתלה לצלחת שש בארות נמוכה מאוד. הזז במהירות את הצלחת קדימה ואחורה, מצד לצד, שש פעמים. לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
תמונות אימונופלואורסצנטיות של הצבירים הראו דומיננטיות של תאים מייצרי אינסולין המבטאים במשותף את סמני תאי הבטא של הלבלב. הביטוי של גנים לחתימת תאי בטא גילה כ-25% מהתאים המבטאים Nkx6.1 ו-40% המבטאים Pdx1. במהלך בדיקת הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז, אשכולות שמקורם ב-MEL1 הפרישו רמות גבוהות משמעותית של אינסולין בתגובה לריכוזי גלוקוז גבוהים בהשוואה לריכוזי גלוקוז נמוכים.
