כדי להתחיל, קח את חלקי המוח פרפין של PFF מוזרק C57 שחור שישה עכברים. מסירים שעווה מהמגלשות על ידי טבילתן בתחליף קסילן ודגירה עליהן למשך שתי דקות. להחזרת נוזלים, טבלו את המגלשות ב-100%95% ובאתנול 70%, ולאחר מכן פעמיים במים נטולי יונים.
מעבירים את הדגימות למיכל מיקרו יחד עם מים מזוקקים כפול. חממו את מאגר הציטראט פי 100 עם pH שש בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להכין 350 מיליליטר של חיץ ציטראט טרי.
יוצקים את מאגר הציטראט המוכן למיכל פלסטיק עם מכסה. הכניסו את המגלשות למיכל חיץ הציטראט והדקו את המכסה. חממו את הדגימות במיקרוגל ב-700 וואט למשך ארבע דקות, ולאחר מכן המתינו זמן למנוחה של חמש דקות.
יש לחמם במיקרוגל למשך דקה וחצי נוספות, ולאחר מכן לנוח חמש דקות ולחדש את מאגר הציטראט. חממו במיקרוגל במשך 1.5 דקות ותנו לו לנוח במשך חמש דקות. לאחר מכן מקררים את הדגימות ואת מאגר הציטראט על קרח במשך 20 דקות ושוטפים אותם במים מזוקקים כפולים.
יבשו את שקופיות הדגימה באמצעות מגבת נייר מבלי לגעת ברקמה. בעזרת עט פאפ, ציירו מלבנים סביב חלקי הרקמה. כעת העבר את כל השקופיות לתיבת צביעה חיסונית של שקופיות.
שטפו אותן בעדינות מספר פעמים עם TBS-T כדי להבטיח שטיפות TBS-T יישארו בתוך מלבני עט ה-PAP. הקישו על השקופיות על מגבת נייר כדי להסיר TBS-T. מוסיפים 50 מיקרוליטר חסימה לכל מלבן ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, באמצעות מגבת נייר, להסיר את הפתרון חוסם מן הדגימות. יש למרוח בעדינות פיפטה 50 מיקרוליטר של תערובת הנוגדנים הראשונית ו-TBS-T לכל מלבן ולדגור על הדגימות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את המגלשות עם TBS-T.
הסר את TBS-T על-ידי הקשה על מגבת נייר. חזור על תהליך זה שלוש פעמים. לאחר מכן, הוסיפו 50 מיקרוליטר של תערובת נוגדנים משנית בדילול אחד עד 1000 ב-TBS-T לכל מלבן ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת בחושך.
לאחר מכן, שטפו את הדגימה שלוש פעמים עם TBS-T. לאחר מכן יש לדגור על הדגימה עם DAPI בריכוז של שני מיקרוגרם למיליליטר ב-TBS-T למשך דקה אחת. הסר את תמיסת DAPI על-ידי הקשה על מגבת נייר וכבס שלוש פעמים באמצעות TBS-T.
כדי להרכיב משטח כיסוי זכוכית, הוסף שתי טיפות לכל שקופית של מגיב הרכבה לדגימות. לחץ על הכיסוי בעדינות כדי למנוע בועות ותן לדגימות להתייבש במשך שעה בטמפרטורת החדר. צלם לפחות 50 תאים בתחומים שונים באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית מובנית של הארה המצוידת בטכנולוגיית מטרת שמן או קונפוקלית פי 60.
כדי לנתח את התאים, בודד את אזור העניין על ידי ציור קווי מתאר סביב התא החיובי או השלילי ושימוש בפונקציית החיתוך. לאחר מכן, הפעל מתארי צורה והגביל לאפשרויות סף בפונקציית המדידה שהוגדרה. התאם את רמת הסף על-ידי בחירת פונקציית הסף בתפריט ההתאמה.
לבסוף, השתמש בכלי ניתוח חלקיקים והגדר גודל מתאים כדי ללכוד את המיטוכונדריה. לדוגמה, הגדר את הגודל ל- 25 אינסוף ולאחר מכן הפעל יחידות פיקסלים ובחר הצג מסכות"Substantial nigra pars compacta of PFF injed עכברים co-amino מוכתמים עבור טירוזין הידרוקסילאז VDAC1, PS129 אלפא-סינוקלאין ו- DAPI מוצגים. צביעת אלפא-סינוקלאין נגד PS129 אפשרה להבחין בין תאים שמכילים נגעי PS129 לבין תאים בריאים.
ניתוח תמונה של צביעת VDAC1 של נוירונים חיוביים של טירוזין הידרוקסילאז גילה ירידה הן בספירת המספרים המיטוכונדריאליים והן ביחס הממדים בין תאי עצב הנושאים נגעי PS129 לבין תאי עצב החסרים אותם.
