כדי להתחיל, בחר צלחת 24 באר המכילה תוספות עם מסננים 0.4 מיקרון. בעזרת פיפטה מוסיפים 500 מיקרוליטר HBSS מתחת ומעל לתוספות המסנן. לאחר מכן לסגור את צלחת רב באר ומניחים אותו באינקובטור במשך שעתיים.
לאחר הדגירה, בזהירות לשאוף HBSS מן הצלחת. הכינו תמיסת קולגן ללא תאים בצינור סטרילי של 50 מיליליטר ב-DMEM על קרח. מוסיפים 250 מיקרוליטר קולגן מעל מסנן הממברנה ומניחים את המכסה על הצלחת.
אפשר לתמיסה להתפלמר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את תרבית תאי הפיברובלסט L-929 מהאינקובטור. הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת טריפסין EDTA שחוממה מראש לבקבוק והניחו אותה באינקובטור למשך שלוש עד חמש דקות.
מעבירים את מתלה התא לצינור סטרילי של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-645 גרם למשך חמש דקות. באמצעות משאבת ואקום, לשאוף את supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של DMEM. הוסף 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתוך צינור המכיל 20 מיקרוליטר של תמיסת Trypan Blue.
והשתמש בתא ספירת תאים כדי להעריך את צפיפות התא. לאחר מכן, להסיר את תרבית תאי מונוציטים U-937 מן האינקובטור. צנטריפוגה את מתלה התא ולהשעות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של סל"ד.
לאחר שווידאתם שהתאים מושהים בצורה הומוגנית, ספרו אותם באמצעות תא ספירת תאים. לאחר מכן, להכין תאים השעיה המכילים 50, 000 L-929 ו 15, 000 U-937 תאים בהתאמה ב 50 מיקרוליטר של DMEM. הוסיפו כל תרחיף של 50 מיקרוליטר ל-450 מיקרוליטר קולגן וערבבו היטב.
שכבו את למינה פרופריה נטולת התאים המקודדת מראש עם 500 מיקרוליטר של תמיסת תאי הקולגן. סוגרים את הצלחת ומניחים אותה באינקובטור למשך שעתיים כדי לאפשר לתמיסה להתמקם. לאחר מכן, להסיר את תרבית התאים Caco-2 מן האינקובטור.
באמצעות משאבת ואקום, שואפים את המדיום ושוטפים את התאים עם 10 מיליליטר של PBS. הוסף חמישה מיליליטר של תמיסת PBS טריפסין EDTA ומקם אותה באינקובטור למשך חמש עד שמונה דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את השעיית התא ולהשעות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של DMEM.
לאחר הספירה, להכין תרחיף התא המכיל 150, 000 תאים Caco-2 ב 50 מיקרוליטר של DMEM. מניחים את הצלחת במכסה מנוע זרימה למינרית למשך 10 דקות לפני העברתה לאינקובטור. לאחר 30 דקות, להוסיף 500 מיקרוליטר של DMEM מעל המודל המשוחזר ו 500 מיקרוליטר מתחת למסנן ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור.
למחרת, בזהירות להחליף את המדיום עם 500 מיקרוליטר של DMEM טרי מעל ומתחת למסנן בהתאמה.
