כדי להתחיל, זרע נפח 200 מיקרוליטר של 10, 000 תאי קרצינומה hepatocellular לתוך צלחת 96 באר עם DMEM ו 10% FBS. לדגור על התאים במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח תחת 5% פחמן דו חמצני. למחרת, החליפו את תרבית החומר וטפלו בתאים בריכוזים משתנים של מי חמצן ומנאדיון.
להמיס חמישה מיליגרם של DHE במיליליטר אחד של DMSO. עבור פתרון העבודה, לדלל aliquot 100 מיקרומול עם מדיה DMEM שחומם מראש לריכוז של 10 מיקרומול. מערבלים את תמיסת הצבע העובדת למשך 5 עד 10 שניות כדי להבטיח ערבוב נכון.
כעת הסר את אמצעי הבדיקה מכל באר לפני שעומדים תאי הקרצינומה. לאחר מכן שטפו בעדינות כל באר עם PBS. פיפטה 100 מיקרוליטר של תמיסת צבע עובד לתוך כל באר.
דוגרים על הצלחת בחום של 37 מעלות למשך 30 דקות. הסר את המדיה המכילה DHE מכל באר. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לשטוף כל באר שלוש פעמים עם PBS.
עכשיו, פיפטה 200 מיקרוליטר של PBS המכיל Hoechst 33342 צבע צביעה גרעינית לתוך כל באר. לאחר הדגירה, להעביר את הצלחת לפלטפורמת סינון תוכן גבוהה. הפעל את תוכנת הסינון Cellomics CX7 בעלת התוכן הגבוה.
כייל את פלטפורמת ההדמיה בהתאם למפרטי היצרן. פתח את פרמטרי המערכת הספציפיים למותג הצלחת במסד הנתונים של המכשיר. לאחר מכן, מניחים בזהירות את הצלחת עם הדגימות על השלב המחומם של מערכת ההדמיה.
ודא שהצלחת ממוקמת היטב ובכיוון הנכון. לאחר מכן לחץ בעדינות כלפי מטה על צלחת המיקרו כדי להבטיח שהיא מונחת שטוחה על הבמה. לאחר שהלוח ממוקם כראוי, לחץ והחזק את מקש Control.
לאחר מכן לחץ על Control and OK כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח Plate Load/Unload . כדי לבחור את פרמטרי ההדמיה, פתח את מצב הפעלת היעד בממשק Cellomics BioApplications. צור פרוטוקול חדש לרכישת נתונים דו-ערוציים התואם לצביעה גרעינית ולגשושית פלואורסצנטית DHE.
לאחר מכן, ציין את המטרות הנדרשות לרכישת תמונה ולאחר מכן בחר את ההגדלה המתאימה. כעת ציין את זמן החשיפה, כיפוף המצלמה ומרווח מחסנית z. לאחר הגדרת פרמטרי ההדמיה, זהה את אובייקט המעקב העיקרי המעניין באמצעות האלגוריתמים השונים במכשיר.
לאחר פילוח האובייקט שזוהה, אמת את האובייקט הראשי בהתבסס על פרמטרי הגודל, הצורה והעוצמה הספציפיים הייחודיים לכל סוג תא. הגדר את אזור העניין סביב האובייקט והגדר מעגל של 20 מיקרומטר סביבו. לחץ על הכרטיסייה אפיון אוכלוסייה, ולאחר מכן הגדר את מגבלת הסריקה ל -1000 תאים לכל באר עם מינימום של 10 אובייקטים לכל שדה.
כעת לחץ על הפעל תצוגה כדי לסרוק כל צלחת באר. לאחר מכן הפעל את תוכנת ניתוח התצוגה וייצא את פרמטרי הנתונים הכמותיים בפורמט CSV לניתוח נוסף. חשיפה למי חמצן הביאה לתוספת מובהקת סטטיסטית של פלואורסצנטיות המושרה על ידי ROS בכל קווי התאים באופן תלוי מינון.
עם מנדיון, תאי JHH-4 הראו תוספת תלוית מינון בעוצמה פלואורסצנטית. עם זאת, ההבדל המשמעותי בפלואורסצנטיות נצפה רק בריכוזים גבוהים יותר בשני קווי התאים האחרים.
