צביעת נויטרופילים אנושיים והכנת צלחת בדיקת נויטרופילים לניתוח תאים חיים

לאחר בידוד נויטרופילים מדם היקפי אנושי, להשעות אותם מחדש RPMI 1640 בינוני בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. הוסיפו מיקרוליטר אחד של דנ"א אדום חדיר ל-1.5 מיליליטר של תרחיף נויטרופילים ודגרו בחושך במשך חמש דקות. צנטריפוגה את תרחיף נויטרופילים ב 2, 500 גרם במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגה, הסר את הצינור המכיל נויטרופילים כדוריים ושאפו את הסופרנטנט. השהה מחדש את הנויטרופילים במיליליטר אחד של RPMI וצנטריפוגה אותו שוב. לאחר השטיפה האחרונה, להשעות מחדש את הנויטרופילים במיליליטר אחד של RPMI.

הוסף נפח קטן של תרחיף נויטרופילים להמוציטומטר וספור אותם תחת מיקרוסקופ. לדלל את תרחיף הנויטרופילים ל 1.5 כפול 10 לנויטרופילים החמישי למיליליטר באמצעות RPMI. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של אחד עד 100 קרום מדולל מראש צבע DNA ירוק בלתי חדיר למיליליטר אחד של תרחיף נויטרופילים.

יש להוציא 100 מיקרוליטר של תרחיף נויטרופילים לכל באר לתוך תרבית רקמה שקופה המטופלת 96 צלחת באר. הוסף 100 מיקרוליטר של RPMI המכיל ריאגנטים גירוי עם או בלי מעכב לתוך הבארות המתאימות. הניחו את הצלחת במערכת ניתוח תאים חיים השוכנת באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני.