כדי להתחיל, להוסיף מיליליטר אחד של מטריצה חוץ-תאית 1% לכל באר של צלחת שש בארות. דוגרים על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני. לאחר שעה, הוסף שני מיליליטר של אמצעי תחזוקה טרום חם המכיל 0.4 מיקרומולר Y-27632 לכל באר.
כדי להפשיר את תאי הגזע העובריים H9, נערו את המלאי הקריוביאלי באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. יש לעקר בזהירות את הקריוביאל עם תרסיס אלכוהול מחטא 75%. לאחר מכן מעבירים את התאים המופשרים לצינור 15 מיליליטר המכיל את אמצעי התחזוקה ו- Y-27632.
צנטריפוגה את הצינור ב 190 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר בזהירות את רוב supernatant ו resuspend את התאים במיליליטר אחד של אמצעי תחזוקה המכיל Y-27632. יש לפזר 0.5 מיליליטר מתרחיף התא לכל באר של הצלחת המצופה מטריצה חוץ-תאית המכילה אמצעי תחזוקה.
נערו את הצלחת לרוחב ודגרו על הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות לפחות. שנה את המדיום כל יום. ברגע שצפיפות השיבוט מגיעה ל -70%, הסר את המדיום שהוצא בשימוש.
לאחר שטיפת PBS דו-ממדית, יש לדגור על התאים עם מיליליטר אחד של EDTA למשך ארבע עד שבע דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את EDTA לחלוטין. הוסיפו מיליליטר אחד של אמצעי תחזוקה לתאים וטפחו על הצלחת בעדינות. לאחר מכן מעבירים את התאים שנעקרו לצינור של 15 מיליליטר ומערבבים אותם שלוש עד חמש פעמים.
הוסיפו 20 עד 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת מצופה ECM שהוכנה בעבר וערבבו היטב. באמצעות מיקרוסקופ, לאשר את צפיפות התא לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני.
