גרימת היווצרות רשתית עצבית תלת-ממדית מתאי גזע עובריים H9-עובריים בתרבית לטיפולים מבוססי תאי גזע

כדי להתחיל, להפשיר ולגדל תאי גזע עובריים H9 באמצעי תחזוקה המכיל Y-27632. ביום האפס, ברגע שהמושבות הופכות ל-70%, שטפו אותן עם 2 מיליליטר של DPBS, ואז דגרו על התאים עם 0.5 מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה של תאים המכילה 20 מיקרומול לליטר Y-27632. כדי להפיל את העיכול, להוסיף 3 מיליליטר של אמצעי תחזוקה המכיל 20 מיקרומול לליטר Y-27632.

כדי להניע את התאים, צנטריפוגו את הצינור ב-190 גרם למשך חמש דקות והשליכו את הסופר-נטנט. יש להשהות מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תווך כימי ללא גורמי גדילה עם Y-27632. לאחר ספירת התאים, הוסיפו 1.2 מיליון תאים ל-10 מיליליטר של תווך כימי ללא גורמי גדילה וערבבו היטב.

לאחר מכן מוציאים 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר של צלחת תחתונה חרוטית היטב. דגירה באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני. כדי לגרום להיווצרות רשתית ביום השישי, יש להוסיף מדיום המכיל BMP4 לכל באר של צלחת 96 באר V-bottom ולדגור שוב.

ביום התשיעי, ה-12 וה-15, החליפו מחצית מהמדיום המשומש במדיום טרי ללא BMP4. ביום ה -18, העבירו בזהירות את גופי העובר שנוצרו לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר המשקעים הטבעיים של גופי העובר, הסר בעדינות את הסופרנאטנט ושטוף אותם עם מדיום התמיינות הרשתית העצבית.

לאחר מכן מניחים את גופי העובר בצלחת שש בארות בעלת ספיגה נמוכה ודגרים שוב על הצלחת. ביום ה-21, תמונות ברייטפילד הראו מבנה נוירואפיתל רציף ברשתית העצבית שנוצר בשיטה זו. שיעור ההצלחה של השראת הרשתית היה גבוה משמעותית ואורגנואידים ברשתית שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה היו דומים בגודל ובמורפולוגיה בהשוואה לשיטות אחרות.