טיהור תאי אנדותל לימפטיים מורין

כדי לטהר תאי אנדותל לימפטיים בשתן, השתמשו בתאים שבודדו מהדרמיס המורין לאחר שהם מגיעים לכ-80% עד 90% Co-fluency, התחילו בשטיפת חרוזים מגנטיים מקודדים מראש במפריד מגנטי באמצעות מיליליטר אחד של תמיסת ציפוי חרוזים מגנטית. להשעות מחדש את החרוזים ב 150 מיקרוליטר של DMEM המכיל 0.1% BSA. לאחר מכן, לשטוף את התאים בצלחת תרבית רקמה 60 מ"מ פעמיים עם PBS.

מערבבים 50 מיקרוליטר של חרוזים מצומדים נוגדנים עם שלושה מיליליטר של DMEM המכיל 0.1% BSA ולהוסיף אותו לתאים. אוטמים את המנה עם ביופילם, ואז דוגרים על המנה על שייקר מתסיס ב-10 סל"ד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בדיוק. יש להשליך את המדיום לפני שטיפת התאים פעם אחת עם PBS.

בדוק במהירות את התאים כדי לאמת את נוכחותן של מושבות LEC על הצלחת. הוסיפו מיליליטר אחד של טריפסין EDTA לתאים ודגרו במשך שלוש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס כדי לבצע טריפסיניזציה של התאים. בדוק את התאים עבור ניתוק מוצלח של התא.

לאחר נטרול התמיסה עם שני מיליליטר של מדיית LEC מלאה. מעבירים את תמיסת התא לצינור פוליפרופילן סטרילי של חמישה מיליליטר. באמצעות מפריד מגנטי, לשטוף את התאים עם שלושה מיליליטר של DMEM המכיל 0.1% BSA כדי להסיר תאים לא קשורים.

השהה מחדש את התאים הנותרים הקשורים לחרוזים במדיית LEC מלאה וצלחת אותם על לוחות תרבית רקמה מצופים קולגן 60 מילימטר. הדמיה של ברייטפילד ופלואורסצנטיות זיהתה בקלות את תאי האנדותל הלימפטיים החיוביים LYVE1 לאחר הטיהור והראתה כמה חרוזים מחוברים אליהם. התאים הפגינו מפגש נמוך 24 שעות לאחר הטיהור, בעוד שהם היו מאוד שוטפים, שבעה ימים לאחר הטיהור.