בידוד גרעינים בודדים מאורגנואידים במוח אנושי לריצוף RNA של גרעין יחיד

כדי להתחיל, העבר ארבעה אורגנואידים אנושיים במוח שנוצרו מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לתוך צלחת בת שש בארות המכילה PBS צונן. חותכים כל אורגנואיד לארבע חתיכות. באמצעות מספריים, לחתוך את קצה 1, 000 מיקרוליטר פיפטה ולהשתמש בו כדי להעביר חתיכות אורגנואיד לתוך douncer שני מיליליטר.

שאפו PBS לחלוטין והוסיפו מיליליטר אחד של מאגר ליזיס NP-40. להקפיץ את האורגנואידים שלוש פעמים עם dounce pestle A ואחריו pestle B.להעביר את המתלה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. לשטוף את הסדרן עם מיליליטר אחד של חיץ ליזיס ולהעביר את הפתרון לצינור צנטריפוגה.

לאחר חמש דקות של דגירה בטמפרטורת החדר, צנטריפוגו את מתלה האורגנואיד ב 500 G למשך חמש דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשאירו 50 מיקרוליטר בשפופרת. הוסף מיליליטר אחד של מדיום NSB Plus לתוך הצינור.

ואחרי חמש דקות, מערבבים כדי להשעות מחדש את הכדור. לאחר הכנת שיפוע פרקול בצינור, מניחים עליו את מתלה האורגנואידים. לאחר מכן, צנטריפוגו את מתלה האורגנואיד השכבתי ב 500 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

שאפו את הסופרנאטנט ותלו מחדש את הגלולה במדיום NSB פלוס. מסננים את תמיסת הגרעינים על מסננת תאים של 40 מיקרון. לאחר מכן, הכתימו את הגרעינים באמצעות DAPI וספרו אותם בתא נויבאואר.

צנטריפוגו את הכמות הנדרשת של תמיסת גרעינים והשהו מחדש את הגלולה בתווך NSB Plus על פי מדריך ערכת snRNA-seq מבוסס מיקרופלואידיקה.