הכנת דגימות של תרביות תאים ושינוי תרמי תאי (CETSA) לכתישה מערבית

בתור התחלה, הוסיפו 264.7 תאים גולמיים לצלחת תרבית של 100 מילימטר ודגרו עם שישה מיליליטר DMEM בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 95% לחות ו-5% פחמן דו חמצני. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 80%, שאפו את התווך הישן, ואז שטפו את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS שחוממו לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של PBS לכל צלחת המכילה תאים ולערבב אותם.

אספו את התאים לשני צינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-377 גרם למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת supernatant, resuspend את התאים בשני מיליליטר של PBS. כעת, יש להקפיא צינורות מיקרוצנטריפוגות בחנקן נוזלי עד להיווצרות מוצק לבן ולהפשיר מיד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה את הצינורות ב 12, 000 G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לקחת שתי צינורות microcentrifuge, אחד עם 100 micromolar Xanthatin ואחד עם נפח שווה של dimethyl sulfoxide. מוסיפים 450 מיקרוליטר של הסופרנאטנט הצנטריפוגי לכל צינור ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר מכן להעביר 60 מיקרוליטר של supernatant מכל צינור מיקרוצנטריפוגה ל 14 צינורות PCR. חממו את הצינורות בו זמנית בטמפרטורות משתנות במשך שלוש דקות עם שני צינורות PCR בכל טמפרטורה. לאחר מכן הניחו את הצינורות בצנטריפוגה.

עכשיו, קחו 48 מיקרוליטר של סופרנאטנט מכל צינור והוסיפו אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר. הוסף 12 מיקרוליטר של מאגר העמסת חלבון SDS-PAGE לכל צינור. חממו את הדגימות המערבולות באמבט מים בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.