התחל על ידי הורדת חצאי מפות לא מחודדות של apo-enolase מנתונים נוספים ב- EMDB. לאחר מכן פתח את ChimeraX ולחץ על פתח בסרגל הכלים. בחר את חצאי המפות של apo-enolase.
הקלד זאת בשורת הפקודה כדי לשלב את חצאי המפות ולקבל את המפה apo-enolase unsharpened. כוונן את סף המפה ל- 0.0595 כדי להפחית רעש. לאחר מכן הקלד פקודה זו כדי לשנות את שם המפה המשולבת.
לחץ על פתח. בחר בחצאי מפות לא מחודדות של PEP והקלד פקודה זו בשורת הפקודה. התאם את סף המפה ל- 0.0721 כדי להפחית רעש ולשנות את שם המפה.
לאחר מכן הציגו את המפות הלא מחודדות apo-enolase ו-PEP ולחצו על Fit בחלונית Map כדי לחשב מפת הבדלים. הקלד פקודה זו בשורת הפקודה כדי להחסיר את מפת PEP enolase ממפת apo-enolase ולהתאים את הסף. צבעו את המפה שהוחסרה בירוק, תוך ציון דחיסות חיובית.
לאחר מכן, פתח PDB והורד את הקואורדינטות של mycobacterium tuberculosis octameric enolase. ואז ב- ChimeraX, לחץ על פתח מסרגל הכלים ובחר את שם הקובץ. לחץ על תצוגת מולקולות, הסתר אטומים והצג קריקטורה.
הקלד פקודה זו כדי לשנות את שם הדגם. בחרו בדגם מהחלונית 'דגם'. לחץ על העכבר הימני מסרגל הכלים.
לאחר מכן לחצו על 'הזז דגם' ומקמו את הדגם בקרבת מפת PEP enolase. יישר את המודל ביחס למפה. התאם מודל זה למפה הלא מחודדת של PEP על-ידי הקלדת פקודה זו בשורת הפקודה.
בדוק את ההתאמה. התאם את ייצוג הצבע והמבנה. פתח Coot מהמסוף על ידי הקלדת coot&לחץ על קובץ, ואז פתח קואורדינטות, ובחר Apo-enolase.pdb.
לאחר מכן, הורד את מפת PEP כרוך enolase מחודד מ EMDB. הצג מפה זו ב- Coot על ידי לחיצה על קובץ ופתח מפה. גלול בלחצן העכבר האמצעי כדי להגדיר את הסף ל- 7.00 סיגמה.
לחץ על Validate ולאחר מכן Unmodeled Blobs. בחלון החדש, הקלד 7.00 בתור RMSD ולחץ על חפש כתמים. אתר את צפיפות הליגנד ללא מודל ליד שאריות האתר הפעיל, סרין 42, ליזין 386 וארגינין 364.
לאחר מכן, לחץ על קובץ, קבל מונומר, והזן PEP כדי לקבל את קובץ מודל מונומר PEP מספריית מונומר קוט. הזיזו את מולקולת PEP לצפיפות בעזרת האפשרות 'סובב מולקולת שרשרת אזור תרגום' בתפריט סרגל הצד. לאחר מכן לחצו על Real Space Refined Zone בתפריט סרגל הצד כדי להתאים למולקולת PEP בצפיפות.
הערך את ההתאמה ולחץ על קבל בסיום. השתמש באפשרות מזג מולקולה בכרטיסיה עריכה כדי למזג את הליגנד המותאם עם מודל apo-enolase ולשמור את המודל כ- PEP enolase.pdb. לאחר מכן לחץ על חישוב, כלי NCS, ואחריו ליגנדות NCS כדי להוסיף ליגנדות לשאר המונומרים בקובץ הקואורדינטות.
עבור האפשרות חלבון עם NCS, בחר את קובץ הקואורדינטות apo-enolase. pdb ומזהה שרשרת A כשרשרת ראשית של NCS. לאחר מכן, עבור המולקולה המכילה ליגנד, בחר apo-enolase.
pdb כקובץ הקואורדינטות, מזהה שרשרת J ושארית מספר 121. לחץ על מצא משרות מועמדים. לחץ על ליגנדות המועמדים הבודדות ונתח את ההתאמה באופן חזותי.
לאחר מכן דגם שני יוני מגנזיום בצפיפות האתר הפעיל על ידי לחיצה על מקם אטום במצביע ובחירת MG מהרשימה סוג אטום מצביע. כמו כן, הוסיפו את יוני המגנזיום במונומרים הקשורים לסימטריה. להעריך את ההתאמה לאטומי מגנזיום הקשורים לסימטריה.
שמור את המודל על ידי לחיצה על קובץ, ולאחר מכן שמור קואורדינטות. בחר שם קובץ והקלדת enolase בתוספת PEP בתוספת MG.pdb. לאחר מכן פתח את ממשק המשתמש הגרפי של פיניקס.
הפעל משימת עידון שטח אמיתית באמצעות פרמטרי ברירת מחדל עם המודל שנשמר ומפה מחודדת מאוגדת PEP. כדי להמחיש את הליגנד המודל, פתח את PyMOL, לחץ על קובץ ופתח כדי לטעון את המודל המעודן מעבודת העידון של פיניקס. טען גם את המפה המחודדת המאוגדת PEP.
שנה את שם המפה כ- PEP מחודד על ידי לחיצה על פעולות ולאחר מכן שנה שם. לאחר מכן בחר את הליגנדות על ידי לחיצה על תצוגה ואחריה רצף. הקלד זאת בשורת הפקודה והקש Enter.
פעולה זו מגלפת את צפיפות המפה סביב הבחירה. לחץ על התיבה האחרונה, C, ליד אובייקט mesh_ligand כדי לשנות את צבע רשת הליגנד לכחול. הצג את שאריות האתר הפעילות המקיימות אינטראקציה עם יוני PEP ומגנזיום בייצוג מקל וכדורי ואנזים אנולז בייצוג קריקטורות.
קבעו גודל רשת שינוי. הקלד זאת בשורת הפקודה כדי לבצע מעקב קרניים ולשמור את התמונה כקובץ PNG. במהלך גליקוליזה, אנולאז ממיר שני פוספוגליצראט לפוספונולפירובט, מתווך חיוני עבור מסלולים מטבוליים שונים.
מפת ההבדלים בין אנזים apo לאנזים PEP הראתה צפיפות ליגנד ברורה. כמו כן, צפיפות נוספת נצפתה באתר הפעיל של החלבון המודל. פוספונולפירובט ושני יוני מגנזיום מודלו בצפיפות שנצפתה בקרבת הליגנד.
פוספונולפירובט יצר קשרי מימן עם מספר שאריות אתר פעילות, כגון ליזין 386 וארגינין 364. יוני המגנזיום יצרו קשרי תיאום מתכות עם אספרטט 241, גלוטמט 283, אספרטט 310 והפוספט של פוספונולפירובט.
