כדי להתחיל, להכין 10 מיליליטר של 2X AlkB תגובה חיץ ולעקר דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרון. בצינור PCR סטרילי, הוסף 20 מיקרוליטר של RNA 1-ligated linker, 50 מיקרוליטר של 2X AlkB reaction buffer, שני מיקרוליטרים של AlkB demethylase, מיקרוליטר אחד של מעכב RNA, ו 27 מיקרוליטר של RNA מים חופשיים כדי להכין תגובת עיכול AlkB. דגרו על תערובת העיכול AlkB בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי להסיר מתילציה שלאחר שעתוק מהרנ"א.
להפרדת פאזה נקייה, הוסיפו 50 מיקרוליטר מים נטולי RNA לתגובת AlkB. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תערובת אלכוהול פנול, כלורופורם ואיזואמיל. נערו את הצינור למשך 10 שניות.
צנטריפוגה את תערובת AlkB ב 16, 000G במשך 10 דקות. מעבירים כ-140 מיקרוליטר של ה-RNA בשכבה המימית העליונה לתוך צינור סטרילי של 1.5 מיליליטר. כדי להסיר שאריות פנול, להוסיף 100 מיקרוליטר של כלורופורם RNA מופק ולנער את הצינור.
צנטריפוגות את התערובת ב 16, 000G במשך 10 דקות ולהעביר כ 120 מיקרוליטר של השכבה המימית העליונה לתוך צינור סטרילי 1.5 מיליליטר. לאחר תגובת שעתוק לאחור, הוסף מיקרוליטר אחד של חמישה נתרן הידרוקסידי מולארי להכלאה cDNA של RNA. דוגרים בטמפרטורה של 93 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות כדי לבצע הידרוליזה של גדיל הרנ"א של הכלאת ה-RNA cDNA.
לאחר מכן, להוסיף 0.77 מיקרוליטר של חמש חומצה הידרוכלורית מולרית כדי לנטרל את התגובה. הכינו ג'ל אגרוז 3% במאגר TAE. מערבבים מיקרוליטר אחד של צבע העמסה 6X לחמישה מיקרוליטרים של מוצר PCR, וטוענים את הג'ל בתערובת.
טען חמישה מיקרוליטרים של 50 או 100 סולמות DNA של זוגות בסיסים לתוך הבאר לפני הדגימה הראשונה והבאר אחרי הדגימה האחרונה. הפעל אלקטרופורזה ג'ל ב 120 וולט ו 400 מיליאמפר במשך 75 דקות כדי לאתר את מוצרי PCR. לאחר אלקטרופורזה, מניחים את הג'ל בקופסה וממלאים אותו במים נטולי יונים, עד שהג'ל שקוע לחלוטין.
מוסיפים למים 10 מיקרוליטר של אתידיום ברומיד. עוטפים את הקופסה בנייר כסף ומכתימים למשך 30 דקות על שייקר. יש להשליך את המים המכילים אתידיום ברומיד לבקבוק פסולת המונח במכסה אדים.
שטפו את הג'ל במים נטולי יונים, פעם אחת והשליכו את המים לבקבוק פסולת. לאחר שטיפת הג'ל עם מים deionized במשך 10 דקות, להשתמש imager ג'ל כדי לדמיין את הלהקות לרכוש תמונה ברזולוציה גבוהה של הג'ל.
