כדי להתחיל, להעביר את כל PEG זירז אדנו וירוס HEK293 תרבית צינור חרוטי גדול. צנטריפוגה התרבות ב 2, 820 גרם במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את הגלולה ב-15 מיליליטר PBS עם סידן ומגנזיום.
מעבירים את החלק המושעה מחדש לצינור של 50 מיליליטר. הוסף 10 מיליליטר של PBS כדי לאסוף את משקע ה- PEG הנותר, והעבר הכל לצינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 40 מיקרוליטר של DNase I, ולדגור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
באמצעות פיפטה פסטר זכוכית, למלא צינור פוליאלומר 25 מ"מ על 89 מ"מ עם 15.5 מיליליטר של ליזט תא מרוכז. בעזרת פיפטה חדשה מזכוכית פסטר, מחדירים בעדינות תשעה מיליליטר של תמיסת 15% יודיקסנול מתחת לליזט התא. לאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של 25% ו 40% יודיקסנול תמיסות.
ולבסוף, להוסיף חמישה מיליליטר של תמיסת 60% יודיקסנול. השתמשו במזרק כדי למלא את הצינור ב-PBS, וודאו שרוב בועות האוויר מוסרות מבלי להפריע לשכבות היודיקסנול. אטמו את הצינור באמצעות ציפוי צינור חשמלי.
בדוק כי השכבות השונות של שיפוע יודיקסנול נראים בבירור. צנטריפוגה את הצינורות באמצעות רוטור לא נדנדה ב 490, 000 גרם במשך שעה אחת ו 10 דקות ב 16 מעלות צלזיוס. בצנטריפוגה, מרכיבים את הצינורות באבזם מתכת.
חבר מחט 19 מד למזרק. לאחר מכן, צור נקב בחלק העליון של הצינור באמצעות מחט 30 מד, משאיר את המחט מוכנסת. נקב בזהירות את הצינור ממש מתחת לממשק 40%60% יודיקסנול, כפי שצוין על ידי מחוון פנול אדום.
ודא ששיקוע המחט פונה לשכבה של 40%. הסר את המחט 30 מד עם היד הלא דומיננטית תוך מיצוי איטי של תערובת וירוס-יודיקסנול. בערך באמצע הדרך, סובבו את המחט כך שהשיפוע יפנה כלפי מטה, והמשיכו במיצוי, תוך הימנעות מאיסוף משכבת החלבון.
לאחר החילוץ, מיד להעביר את צינור ultracentrifuge לצינור 50 מיליליטר כדי להשליך אותו. הוסף תרחיף AAV-יודיקסנול שנאסף לצינור של 15 מיליליטר, ודלל אותו פי חמישה ב- PBS, תוך מילוי עד 15 מיליליטר. העבר את המתלה לצינור מסנן צנטריפוגלי וצנטריפוגה ב 3, 428 גרם למשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
לאחר השלכת הזרימה, הוסף 15 מיליליטר של PBS 5% סוכרוז לתסנין והשהה מחדש. אסוף את ה- AAV המרוכז מצינור המסנן הצנטריפוגלי. לבסוף, לאחסן את aliquot וירוס ב 4 מעלות צלזיוס עד שלושה חודשים.
