בידוד גרעינים חד-תאיים מדגימות רקמת שומן בין-שרירית אנושית הומוגנית לריצוף RNA

לאחר איסוף רקמת שומן בין-שרירית אנושית הומוגנית לתוך צינור קישור נמוך של 1.7 מיליליטר על קרח, הוסף 14 מיקרוליטר של 10% טריטון X-100 להומוגנאט. דוגרים על הצינור בחושך על קרח למשך 10 עד 15 דקות תוך כדי ערבול כל שלוש דקות. בצינור חרוטי נפרד של 15 מיליליטר, אחד רטוב מראש 100 ואחד מסננת תאים 40 מיקרון עם 100 מיקרוליטר של DPBS.

מסננים את ההומוגנט דרך מסננת תאים של 100 מיקרון. יש לשטוף צינור בעל קישור נמוך של 1.7 מיליליטר עם חיץ הומוגניזציה של 400 מיקרוליטר ולסנן את המתלה עד למסננת תאים של 100 מיקרון. לאחר מכן, סנן את התרחיף המתקבל באמצעות תסנין 100 מיקרון על מסננת תאים 40 מיקרון.

מפזרים באופן שווה את התמיסה לשני צינורות קישור נמוך מקוררים מראש של 1.7 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינורות ב 2700G במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. יש להשליך את שכבת השומנים העליונה ואת הסופרנטנט, ולהשאיר כ-50 מיקרוליטר בצינור הראשון.

פיפטה עדינה למעלה ולמטה 20 פעמים מבלי ליצור בועות כדי להשהות מחדש את הגלולה בצינור הראשון ולהעביר את המתלה לצינור חדש 1.7 מיליליטר קישור נמוך. לאחר מכן, להוסיף 500 מיקרוליטר של מדיום בידוד גרעינים לצינור קישור נמוך 1.7 מיליליטר ולערבב עם pipetting. צנטריפוגה את הצינור ב 1000G במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.

הסר את supernatant, משאיר כ 50 מיקרוליטר בצינור פיפטה בעדינות כדי להשעות מחדש את הכדור. לאחר מכן, מוסיפים 200 מיקרוליטר של מדיום בידוד גרעינים, ומערבבים את התרחיף. הוסיפו טיפה אחת מתמיסת צביעת התאים החיים ודגרו בחושך על קרח.

לאחר 15 דקות, סנן את התמיסה דרך מסננת תאים של 30 מיקרון. מערבבים את תמיסת הגרעינים ומוסיפים 10 מיקרוליטר לשקופית תא ספירת תאים. ספור את הגרעינים באמצעות מונה תאים אוטומטי.