כדי להתחיל, להשיג תאי THP-1 ממוינים ולהסיר את המדיום בילה מן הבארות של צלחת התרבית לאחר שטיפת התאים עם PBS, להוסיף מדיום ללא סרום המכיל lipopolysaccharide, או LPS, לתאים לדגור את הצלחת. לאחר מכן הוסף את אדנוזין טריפוספט או תמיסת מלאי ATP לקבוצת המודל ודגר על הצלחת במשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, שאפו את כל הסופרנאטנט מבארות צלחת התרבות.
לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBS, להוסיף 500 מיקרוליטר של 0.05% טריפסין ללא EDTA לכל באר לדגור במשך 30 שניות. כדי לעצור את ניתוק התא, הוסף מיליליטר אחד של מדיום RPMI 1640 והעבר את התאים לצינור של חמישה מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור ב 300 G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר השעיה מחדש של התאים במיליליטר PBS אחד, הניחו את הצינור עם התאים באמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות וצנטריפוגה. כדי להשעות מחדש את התאים, הוסף 100 מיקרוליטר של חיץ קשירה 1X והעבר את התאים לצינור חדש של חמישה מיליליטר. לדגור על צינורות הבקרה והדגם עם ריאגנטים מתאימים בחושך בטמפרטורת החדר.
כדי לסיים את הדגירה, להוסיף 400 מיקרוליטר של PBS לצינור ולסובב אותו בעדינות. סננו את תרחיף התא ברשת ניילון 35 מיקרומטר המקובעת לצינור חמישה מיליליטר, פוליסטירן, בעל תחתית עגולה. טובלים נקייה בתמיסת אלום כרום למשך שעתיים ומייבשים אותה בתנור בטמפרטורה של 18 מעלות.
פלטו את תאי הטריפסינציה כפי שהודגם קודם לכן, וקבעו את התאים עם 500 מיקרוליטר של מיקרוסקופ אלקטרונים המקובע למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר איסוף התאים מהתמיסה הקבועה, גלולה אותם ב 300 גרם במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 100 מיקרוליטר PBS ונושפים בעדינות את התאים.
זרוק את מתלה התא על זכוכית כיסוי ותן לו לעמוד במשך חמש דקות. שאפו את כל הסופרנאטנט ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות כל אחד. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע חומצה אוסמית 1%.
אחרי שעה, שאפו את כל הסופרנטנט. לאחר שלוש שטיפות PBS, יש לייבש את הדגימות בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול. הפעילו את מייבש הנקודות הקריטיות, פתחו את מיכל הפחמן הדו-חמצני וקררו את התא ל-10 מעלות צלזיוס.
עטפו במהירות את הדגימה בנייר סינון והכניסו אותה לתא כאשר לחץ התא הוא אפס פאונד לאינץ' מרובע. ברגע שהטמפרטורה מתייצבת ל 35 מעלות צלזיוס והלחץ מגיע ל -1, 250 פאונד לאינץ 'מרובע, לחץ על 100 פאונד לאינץ 'מרובע לדקה. הוציאו את הדגימה כאשר לחץ התא הוא אפס.
לבסוף, באמצעות סרט מוליך, להרכיב את הדגימות על מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, מחזיקי דגימות אלומיניום באמצעות מקודד sputter. כסו את הדגימות בשכבה של שניים עד חמישה ננומטר של זהב. ניתוח ציטומטריית זרימה הראה כי לאחר גירוי LPS/ATP, התאים באזור QT גדלו באופן משמעותי מה שמצביע על מוות תאי.
סריקת מיקרוגרפים אלקטרוניים של פני השטח של קרום הפלזמה הראתה מאפיינים של פירופטוזיס, כולל דימום קרום וקרע בתאים מעוררי LPS/ATP, בעוד תאי הבקרה נראו נורמליים. בנוסף, גירוי LPS/ATP הוביל להופעת מאפיינים אפופטוטיים בתאים כגון דימום קרום והתכווצות תאים, ונצפו תאים עם מאפייני נקרופטוזיס הכוללים נפיחות תאים וקרע בקרום.
