כדי להתחיל, לבודד ו cannulate את כלי הלימפה mesenteric של חולדה המתת חסד. לחץ על כלי הלימפה בתא השפע ואפשר להם לאזן ולפתח התכווצויות ספונטניות יציבות. לאחר מכן לדגור את כלי הלימפה עם Fura-2-acetoxymethyl אסטר וחומצה pluronic במשך 30 דקות בחושך.
לאחר הדגירה, רוקנו את נפח האמבטיה המלא עם ואקום בלחץ שלילי ומלאו אותו בתמיסת מלח פיזיולוגית תואמת טמפרטורה ונטולת ריאגנטים שלוש פעמים. לאחר מכן לדגור את כלי הלימפה בחושך במשך 15 דקות נוספות כדי להסיר כל אינדיקטור עודף ולאפשר deesterification. העבר את התא למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך עם אור LED, אובייקט פלואורס 20XS, מתאם מסגור עצמי ומצלמה ללכידת פלואורסצנטיות של 15 הרץ.
חבר את המיקרוסקופ למחשב המצויד בתוכנת הדמיה כדי להקליט פלואורסצנטיות ולבצע זיהוי קצה. הפעל את מקור תאורת ה-LED ואת ממשק המערכת הפלואורסצנטית. עכשיו להפעיל את התוכנה IonWizard.
תחת הכרטיסיה קובץ, בחר באפשרות חדש. לאחר מכן עבור אל הכרטיסיה איסוף ובחר ניסוי. טען את תבנית הניסוי הרצויה ולחץ על אישור. לחץ על לחצן התחל הממוקם בתחתית המסך כדי להתחיל את הניסוי.
לאחר מכן, התאימו את העקבות שעל המסך כדי להציג את קוטר כלי השיט, המונה, אות 340, המכנה, אות 380 והיחס בסדר יורד. כדי לשנות את קנה המידה של ציר Y לקבלת תצוגה חזותית טובה יותר של מעקב, עבור אל מעקבים, ודא שהאפשרות מגבלות אוטומטיות אינה מסומנת ובחר ערוך מגבלות משתמש. בחר את הפרמטר שברצונך להתאים, הזן את ערכי המינימום והמקסימום עבור הציר ולאחר מכן בחר אישור כדי לאשר.
באמצעות תוכנת זיהוי הקצה, התאם את התאורה כך שדופן כלי הלימפה תופיע כקווים כהים. בחר אזור עניין או החזר השקעה ללא שומן ולכלוך, והקפד לא להזיז החזר השקעה זה. הגדר את הסף כך שקצה דופן הכלי יזוהה לאורך כל מחזור ההתכווצות.
לאחר הפעלת צינור מכפיל התמונה, באמצעות תאורת LED לסירוגין אורכי גל של 340 ו -380 ננומטר וחשיפות של 50 מילי-שניות כדי לעורר את Fura-2. צלם את ספקטרום הפליטה במהירות של 510 ננומטר ו-15 הרץ בכל שדה ההדמיה. כדי למדוד את יחס האות לרקע, תחילה לקבל את פלואורסצנטיות 340 ו 380 עם כלי הלימפה במרכז שדה הראייה.
לאחר מכן הזיזו את שדה הראייה לקצה האמבטיה ללא כלי כדי ללכוד את הרקע. לאחר מכן, החליפו את תמיסת האמבטיה בתמיסת מלח פיזיולוגית תואמת טמפרטורה ונטולת מגיבים כדי להסיר עודפי מחוון Fura-2. הקלט אות פלואורסצנטי Fura-2 בסיסי והתכווצויות ספונטניות במשך כ-30 דקות.
לאחר מכן רשום את תגובת הריכוז המצטברת של Nifedipine וקבל מדידות רקע עבור כל ריכוז תרופה. בסוף כל ניסוי, שטפו את כלי הלימפה בתמיסת מלח פיזיולוגית תואמת טמפרטורה ונטולת סידן כדי לקבל את האות הפלואורסצנטי המינימלי Fura-2 ואת הקוטר המרבי של כלי הלימפה בהיעדר יוני סידן. החליפו את תמיסת האמבטיה בתמיסת מלח פיזיולוגית תואמת טמפרטורה המכילה יוני סידן 10 מילימולרים ויונומיצין כדי לקבל את האות הפלואורסצנטי המרבי של Fura-2 ואת הקוטר המינימלי של כלי הלימפה בתנאים של יוני סידן רוויים.
הפרמטרים, כולל משרעת ספייק סידן, סידן בסיסי ושיא סידן הציגו ירידה תלוית ריכוז עם תוספת מצטברת של ניפדיפין לתא הזילוח. במקביל, פרמטרים של התכווצות, כגון התכווצות, משרעת וזרימה מחושבת, הדגימו גם הם ירידה הדרגתית. תרשימי מנהטן הראו את תגובות כלי הלימפה הבודדים למדדי קצב, כולל מרווח, זמן התכווצות וזמן הרפיה.
