כדי להתחיל, זרע HEK293T תאים לתוך מפעל תאים 10 שכבות המכיל DMEM מדיה גלוקוז גבוהה עם 10% FBS. הניחו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת תוספת פחמן דו חמצני של 5% למשך הלילה. לאחר מכן, aliquot 350 מיליליטר של Opti-MEM לתוך בקבוק סטרילי 500 מיליליטר.
מוסיפים את הדנ"א של הפלזמה לטרנספקציה לתוך הבקבוק ומנערים כדי לערבב היטב. כעת הוסף 15 מיליליטר של תמיסת PEI לבקבוק. נערו את התערובת במרץ במשך 30 שניות כדי להבטיח ערבוב אחיד.
לאחר הדגירה על התערובת בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות, מעבירים אותה לבקבוק של ליטר אחד. לאחר מכן להוסיף 700 מיליליטר של DMEM גלוקוז נמוך. מוציאים את מפעל התאים בן 10 השכבות מהאינקובטור ושואבים את המדיה לתוך מיכל פסולת.
הכניסו בזהירות את תערובת הטרנספקט של הדנ"א למפעל התא. לאחר מכן החזירו את Cell Factory לאינקובטור למשך 72 עד 96 שעות. לאחר שלושה עד ארבעה ימים, סננו את הסופרנאטנט המזוקק דרך יחידת סינון של 0.45 מיקרומטר.
הוסף 500 מיליליטר של DPBS למפעל התאים כדי לשטוף אותו. צנטריפוגה זה ב 4, 000 גרם במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת מערכת ואקום ופיפטה שואפת, מוציאים ומשליכים את הסופרנטנט.
מוסיפים 20 מיליליטר של AAV Lysis Buffer לגלולה ומערבבים כדי להשהות מחדש את הגלולה בחיץ. יש לאחסן בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס עד לטיהור. כעת הוסף תמיסת נתרן כלורי 40% PEG לתמיסת AAV, מה שהופך את הריכוז הסופי עד 8% PEG.
הניחו את התערובת על מסובב אורביטלי במהירות נמוכה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. צנטריפוגה של הפתרון ב 4, 000 גרם במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לזרז את הנגיף. פיפטה החוצה את supernatant.
לאחר מכן היו חמישה עד 10 מיליליטר של חיץ מתלה AAV HEPES לכדור. מעבירים את המתלה לתוך צינור חרוטי של 50 מיליליטר כדי להמשיך את הטיהור במורד הזרם. לאחר מכן, תקן מחט מנוקבת 16 מד המותקנת על מזרק 10 מיליליטר ושכב את שיפועי היודיקסנול המוכנים לתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה פוליפרופילן עגול.
עם מחט של 22 מד, הוסף בזהירות עד 17 מיליליטר של תמיסת AAV על גבי השיפוע. מעל הצינור עם חיץ דיאליזה AAV. אטמו את הצינורות עם אוטם חשמלי.
צנטריפוגה צינורות ב 350, 000 גרם במשך שעתיים ברוטור טיטניום בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן העבירו אותם למתלה צינור אולטרה-צנטריפוגה. כעת השתמש במחט חדשה של 18 מד כדי להעביר את נגיף ה- AAV לקלטת דיאליזה.
מוציאים את האוויר מהקלטת לאחר הזרקת הנגיף לתוכה. מניחים חטיף ערבוב בכד המכיל את מאגר הדיאליזה AAV ומעבירים אותו לצלחת ערבוב. לאחר מכן הניחו את קלטת הדיאליזה במאגר עם מצוף צף.
השתמש מזרק 10 מיליליטר כדי להעביר את הנגיף מן הקלטית לתוך יחידת מסנן צנטריפוגלי. צנטריפוגה ב 4, 000 גרם במשך 15 עד 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. אסוף את ה- AAV המרוכז מיחידת הסינון.
לאחר מכן שטפו את המסנן עם 300 מיקרוליטר של מאגר דיאליזה AAV. לבסוף, העבירו את תמיסת השטיפה ל-AAV המרוכז. נגיף ה-AVV המבודד נמצא בעל טוהר של יותר מ-90%, מה שהופך אותו מתאים לשימוש in vivo.
