דיסוציאציה ראשונית של נוירון ההיפוקמפוס וציפוי למדידת ההשפעות של חלבונים פתולוגיים על הובלה אקסונלית

התחילו על ידי ניתוח ההיפוקמפוס ממוחו של עכבר עוברי והניחו את הרקמה המנותחת במאגר סידן קר כקרח וללא מגנזיום או CMF. לאחר מכן, הסר את ה- CMF ושטוף את הרקמה ארבע פעמים עם CMF קר טרי, מערבל את הצינור בעדינות בין שטיפות. לאחר מכן מוסיפים תמיסת טריפסין מסוננת 0.125% ודגרים במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך ערבול כל חמש דקות.

לאחר הדגירה, להסיר את תמיסת טריפסין ולשטוף פעמיים עם CMF קר כקרח. לאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של פתרון inactivation טריפסין. לאחר מכן, כדי לנתק את התאים, טיטרט 30 פעמים באמצעות שתי משיכות שניות עם מחט 14 מד מחובר מזרק שלושה מיליליטר.

המשך טיטרציה עם שתי משיכות שניות 30 פעמים באמצעות מחט של 15 מד, לאחר מכן 20 פעמים באמצעות מחט של 16 מד, ולאחר מכן 20 פעמים עם מחט של 18 מד. לאחר מכן בצע משיכות של שלוש שניות באמצעות מחט של 21 מד 15 פעמים כדי להשלים את הדיסוציאציה של התא. בדוק אם יש גושי תאים על ידי הנחת טיפה של תרחיף התא על שקופית מיקרוסקופ.

לאחר מכן, סנן חמישה מיליליטר של FBS באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרון. שכב בעדינות את מתלה התא על FBS בצינור חרוטי 15 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים ב 200 x גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.

הסר FBS והשהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיה נוירובזאלית חמה ללא אנטיביוטיקה. לדלל את תרחיף התא ב 0.4% טריפאן כחול ולקבל ספירת תאים. צלחת את התאים ב 750 מיקרוליטר של מדיה נוירובזאלית ללא אנטיביוטיקה בשקופית 4 תאים מצופה פולי-D-ליזין שחוממה מראש.

דגרו על התאים בתא מבוקר לחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.