ניתוח קומפלקסי-על מיטוכונדריאליים בשברי רקמות יונקים באמצעות בדיקות פעילות בג'ל

התחילו על ידי השעיה מחדש של שברים מיטוכונדריאליים המתקבלים מתרביות תאים של יונקים או רקמות במאגר דגימה טבעי כחול כדי לקבל ריכוז חלבון של כ -10 מיליגרם למיליליטר. כדי להמיס את קרומי המיטוכונדריה, הוסיפו דיגיטונין כדי לקבל יחס של ארבעה גרם דיגיטונין לגרם חלבון מיטוכונדריאלי. מערבבים על ידי פיפטינג עדין, ודגרים על קרח במשך חמש דקות.

צנטריפוגה את המתלה במיקרופוגה ב 20, 000 G במשך 25 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר חומר מסיס. אוספים את הסופרנאטנט בשפופרת טרייה, מוסיפים 5% Coomassie blue G-250, שווה ערך לשליש מנפח המתלה הראשוני, ומערבבים באמצעות פיפט. הוסף קתודה קרה חיץ לתוך החדר העליון של מכשיר אלקטרופורזה וחיץ אנודה לתוך החדר התחתון.

העמיסו 30 עד 100 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לתוך הבארות על ג'ל פוליאקרילאמיד. לאחר אלקטרופורזה, מניחים את הג'ל בקופסת פלסטיק. יש להוסיף כמות מספקת של תמיסת בדיקת פעילות ג'ל המתאימה כדי לכסות את הג'ל, ולדגור בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין, הגנה מפני אור.

כאשר התפתחו הפסים המתאימים, הסר את פתרון הבדיקה. שטפו את הג'ל פעמיים במים מזוקקים לפני שתיקנו אותו עם 40% מתנול ו-10% חומצה אצטית למשך 30 דקות. ניתוח פעילות הג'ל חשף דפוסי הרכבה ייחודיים של סופר קומפלקס בעכברים ובתאים אנושיים.

קומפלקס חופשי 1 נצפה בתאי עכבר, בעוד שלא ניתן היה להבחין בו במיטוכונדריה אנושית. תבניות קומפלקס 4 היו דומות בקווי תאים אנושיים, אך השתנו בקווי תאי עכבר עקב גרסה מוטנטית של SCAF1.